试述白血病EDAG调控GATA-1稳定性及红系分化作用

论文导读：
摘要：红系分化相关基因（EDAG）是造血组织特异表达的转录调节因子，参与调控造血细胞的增殖、分化和凋亡，在造血谱系分化平衡的历程中发挥关键作用，但目前对其发挥功能的作用机制探讨不尚清楚。本论文以蛋白质相互作用为基础，深入探讨了EDAG与红系/巨核转录因子GATA-1及血液肿瘤标志物蛋白质NPM1的相互作用，探讨EDAG对造血系统和白血病发生的作用机制。本探讨发现EDAG是一个新的GATA-1相互作用蛋白质，证实EDAG与GATA-1有着相互作用，并确定了它们相互作用的结构域。进一步的探讨发现在HEK293细胞中过表达EDAG能够增强GATA-1的稳定性，延长GATA-1蛋白质的半衰期。构建过表达和敲低EDAG蛋白质的K562细胞稳定株，证明在CHX和PMA处理的历程中EDAG能够稳定内源GATA-1的蛋白质水平，降低GATA-1降解。进一步探讨发现EDAG能够增强GATA-1的转录活性，提升GATA-1的DNA能力。在Epo诱导CD34+细胞向红系分化的历程中，EDAG能够稳定内源的GATA-1蛋白质水平，EDAG敲低抑制HSP70入核推动GATA-1被caspase3切割，并且抑制红系分化。NPM1是与白血病发生密切相关的核仁蛋白，本实验室前期发现EDAG与NPM1有着相互作用，初步探讨表明EDAG可能调控NPM1蛋白质稳定性。本探讨利用Co-IP的策略确定了NPM1与EDAG相互作用结构域在NPM1的118-187aa。在CHX的处理下K562细胞过表达EDAG提升NPM1蛋白质稳定性，用慢病毒感染的策略敲低EDAG则推动NPM1蛋白质的降解。在PMA诱导K562细胞向红系分化的历程中过表达EDAG阻止NPM1蛋白质的下调，敲低EDAG后加速NPM1蛋白质下调。初步的实验表明EDAG可抑制NPM1的泛素化。对EDAG稳定NPM1蛋白质的生物学作用探讨发现，在K562细胞中敲低EDAG后增加了由imatinib诱导的细胞凋亡，NPM1过表达则阻止凋亡的增加。这些结果表明EDAG通过与NPM1的相互作用增强NPM1蛋白质的稳定性，EDAG可能在白血病细胞抗凋亡的历程中发挥着关键的作用。此外，本探讨还发现EDAG是p300的新底物，EDAG可被p300催化发生乙酰化修饰；通过免疫沉淀联合质谱的策略确定EDAG有着3个乙酰化位点(K189,K327, K341)；乙酰化位点突变能够增强EDAG自身稳定性，推动EDAG与GATA-1之间的相互作用。综上，我们发现EDAG可通过稳定GATA-1稳定性调控红系分化，并通过调控NPM1蛋白质稳定性在白血病化疗药物抗性中发挥作用。p300对EDAG的乙酰化修饰可调控EDAG蛋白质稳定性。关键词：EDAG论文GATA-1论文红系分化论文NPM1论文白血病论文蛋白质稳定性论文
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ABSTRACT4-6
目录6-10
前言10-12
第一章 文献综述12-34

1.1 造血干细胞12-13

1.2 转录因子是决定 HSC 分化命运的关键因素13-17

1.2.1 转录因子决定 HSC 细胞命运的方式13-15

1.2.2 转录因子调控造血模型15-17

1.3 EDAG 是调控 HSC 增殖分化的重要转录调节因子17-20

1.3.1 EDAG 基因的发现17-18

1.3.2 EDAG 参与造血细胞增殖与分化18-19

1.3.3 EDAG 与转录因子 GATA-1 有着正反馈调控19

1.3.4 EDAG 异常表达与白血病发生相关19-20

1.3.5 EDAG 作用机制的探讨20

1.4 红系/巨核系转录因子 GATA-120-25

1.4.1 GATA-1 蛋白质的结构与功能20-21

1.4.2 GATA-1 的活性调控21-23

1.4.3 GATA-1 的靶基因23-25

1.5 组蛋白乙酰转移酶 CBP/p30025-27

1.5.1 CBP/p300 的蛋白质结构25-26

1.5.2 CBP/p300 的活性与底物26-27

1.5.3 CBP/p300 的功能27

1.6 NPM127-32

1.6.1论文导读：2.3HEK293细胞中过表达EDAG增强GATA-1蛋白质稳定性56-592.2.4K562细胞中EDAG稳定GATA-1的蛋白质水平59-632.2.5EDAG增强GATA-1与DNA的结合能力63-642.2.6EDAG增强GATA-1转录活性64-652.2.7CD34+细胞中敲低EDAG下调GATA-1表达65-682.2.8EDAG敲低抑制HSP70入核推动GATA-1被caspase3切割68-
NPM1 结构27-28

1.6.2 NPM1 的功能28-29

1.6.3 NPM1 与癌症29-30

1.6.4 NPM1 与血液肿瘤30-31

1.6.5 NPM1 活性调控31-32

1.6.6 NPM1 相互作用蛋白质32

1.7 本课题探讨的作用32-34

第二章 EDAG 增强 GATA-1 稳定性，调控红系分化34-77

2.1 材料与策略34-50

2.

1.1 主要仪器设备34-35

2.

1.2 主要试剂及试剂盒35-36

2.

1.3 常用溶液的配置36-38

2.

1.4 菌株和载体38

2.

1.5 载体的构建（以 GATA-1 慢病毒载体为例）38-42

2.

1.6 实验所需细胞42

2.

1.7 细胞培养、冻存及复苏42-43

2.

1.8 细胞总蛋白的提取43

2.

1.9 质粒 DNA 的提取43-44

2.

1.10 哺乳动物细胞转染44

2.

1.11 荧光素酶报告基因实验44

2.

1.12 免疫共沉淀 Co-IP44-45

2.

1.13 间接免疫荧光45

2.

1.14 Western blot45-46

2.

1.15 细胞核质分离46

2.

1.16 EMSA46-47

2.

1.17 流式细胞术检测细胞表面标志47-48

2.

1.18 慢病毒的包装、浓缩、感染和低度测定48-49

2.

1.19 脐带血 CD34+细胞分离49-50

2.

1.20 慢病毒对 CD34+细胞的感染50

2.2 实验结果50-74

2.1 表达载体的构建50-52

2.2 EDAG 和 GATA-1 相互作用结构域的确定52-56

2.2.3 HEK293 细胞中过表达 EDAG 增强 GATA-1 蛋白质稳定性56-59

2.4 K562 细胞中 EDAG 稳定 GATA-1 的蛋白质水平59-63

2.5 EDAG 增强 GATA-1 与 DNA 的结合能力63-64

2.6 EDAG 增强 GATA-1 转录活性64-65

2.7 CD34+细胞中敲低 EDAG 下调 GATA-1 表达65-68

2.2.8 EDAG 敲低抑制 HSP70 入核推动 GATA-1 被 caspase3 切割68-71

2.9 EDAG 敲低抑制 CD34+细胞向红系分化71-74

2.3 讨论74-75

2.4 小结75-77

第三章 EDAG 与 NPM 相互作用的探讨77-95

3.1 材料与策略77-80

3.

1.1 主要仪器设备77

3.

1.2 主要试剂及试剂盒77

3.

1.3 常用溶液的配置77-78

3.

1.4 菌株和载体78

3.

1.5 实验所需细胞78

3.

1.6 细胞总蛋白的提取78

3.

1.7 RNA 的提取78

3.

1.8 RT-PCR78-79

3.

1.9 荧光定量 PCR 技术79

3.

1.10 免疫共沉淀 Co-IP79

3.

1.11 Western blot79

3.

1.12 细胞凋亡79

3.

1.13 统计学浅析79-80

3.2 实验结果80-92
3.

2.1 EDAG 与 NPM1 相互作用结构域的确定80-81

3.

2.2 EDAG 过表达不影响 NPM1 的 mRNA 水平81-82

3.

2.3 K562 细胞中过表达 EDAG 稳定 NPM1 蛋白质82-85

3.2.4 在 PMA 诱导 K562 细胞向巨核分化历程中敲低 EDAG 加速 NPM1 蛋白质的下调85-86
3.

2.5 HSC 在体外培养历程中 EDAG 能够稳定 NPM1 蛋白质86-87

3.2.6 K562 细胞中 EDAG 稳定 NPM1 蛋白质依赖于其相互作用结构域（1-124aa）87-89
3.

2.7 EDAG 通过抑制 NPM 泛素化稳定 NPM1 蛋白质水平89

3.2.8 过表达 NPM1 减少由 imatinib 诱导的 EDAG 敲低后 K562 细胞凋亡89-92

3.3 讨论92-94

3.4 小结94-95

第四章 乙酰化修饰是 EDAG 稳定性调控的重要机制95-107

4.1 材料与策略95-97

4.

1.1 主要仪器设备95

4.

1.2 主要试剂及试剂盒95

4.

1.3 常用溶液的配置95

4.

1.4 菌株和载体95

4.

1.5 EDAG 乙酰化突变体的构建95-96

4.

1.6 实验所需细胞96

4.

1.7 细胞总蛋白的提取96

4.

1.8 免疫共沉淀 Co-IP96

4.

1.9 Western blot96

4.

1.10 考马论文导读：

斯亮蓝染色96-97

4.

1.11 统计学浅析97

2 实验结果97-105 4.

2.1 EDAG 可以被 p300 乙酰化修饰97-98

4.

2.2 P300 对 EDAG 乙酰化位点的确定98-102

4.

2.3 EDAG 乙酰化位点突变可以推动自身稳定性102-104

4.

2.4 EDAG 乙酰化位点突变可以推动其 GATA-1 相互作用104-105

4.3 讨论105-106

4.4 小结106-107

第五章 结论与展望107-109

5.1 结论107-108

5.

1.1 EDAG 稳定 GATA-1 蛋白质调控红系分化107

5.

1.2 EDAG 与 NPM 相互作用的探讨107

5.

1.3 乙酰化修饰是 EDAG 稳定性调控的重要机制107-108

5.2 展望108-109
参考文献109-127
附录

一、PCR 引物127-129

附录

二、英文缩略语129-131

发表论文和参加科研情况说明131-132
致谢132