试议层析肠出血性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体及胶体金免疫层析试纸条研制

论文导读：
摘要：肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia cop, EHEC)0157：H7是一种重要的食源性病原菌,1982年该菌首先在美国被发现,此后在世界各地散发或地方流行。该菌感染可引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)、血栓性血.小板减少性紫癜(TTP)等全身性并发症。反刍动物是EHEC O157:H7的三要贮存宿主,国内外均有以牛羊等动物的粪便中分离到该菌的报道,目前普遍认为受污染的环境、食物和水源是本病的主要传播媒介。建立和改善动物性食品及环境中EHEC O157:H7的检测手段,是进行流行病学调查以及该病防控的关键不足之一。虽然分离培养鉴定仍是检测EHEC0157：H7的金标准,但通常需要数天才能得到结果,不能满足快速诊断的需要。分子生物学和免疫学策略因具有特异、敏感、快速等特点在EHEC O157:H7检测和诊断中发挥着愈来愈重要的作用。探讨一：将E. cop0157：H7用甲醛灭活,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了5株能稳定分泌抗E. cop0157：H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为181、2D6、2D9、2E3和2G5。其中2G5的Ig亚类为IgG3,其余四株均为IgM,轻链均为K型,腹水抗体ELISA效价分别为1×105、1×104、1×106、1×107、1×107,凝集试验显示五株单抗与EHEC O26:H11、 EHEC O111等其他受试菌株均不反应,具有良好的特异性。探讨二：采取柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用纯化的单克隆抗体2G5标记,制备金标抗体玻璃纤维素膜；将纯化的2E3固定于硝酸纤维素膜(NC)上作为捕获抗体；组装成双抗夹心法O157：H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157：H7,敏感度为106CFU/ml,在1～5min内可得出检测结果,与EHECO26：H11、EHEC O111等其他受试菌株均不反应；敏感性高,特异性强,便于O157：H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。探讨三：采取灌胃攻毒方式,使小鼠感染O157：H7,用大肠杆菌157检测试纸条与O157：H7鉴别培养基细菌培养计数两种策略检测感染小鼠粪便中的O157：H7的排菌量和排菌持续时间。结果显示小鼠在感染O157：H7后2h开始粪便排菌,6h达到峰值,排菌时间最长可持续15d。大肠杆菌O157检测试纸条与O157：H7鉴别培养基细菌培养计数两种策略的检测结果一致,试纸条更简便、快捷、直观,在1～5min内可得出检测结果,便于O157：H7临床样品的快速检测以及粪便、食品、环境污染物、水样等现场检测样品中O157：H7的快速筛查。本实验为O157：H7流行病学、致病机理和防控探讨提供了动物模型和检测手段。关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7论文单克隆抗体论文胶体金免疫层析试纸条论文动态检测论文
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Abstract5-8
目录8-11
符号说明11-12
文献综述12-29
1 病原学12-13
2 流行病学13-14
3 致病机理14-15
4 临床特点15-16
5 毒力因子16-22

5.1 志贺毒素17-18

5.2 紧密粘附素18-19

5.3 溶血素19-20

5.4 外膜蛋白20

5.5 脂多糖20

5.6 菌毛20-21

5.7 其他相关因子21-22

6 EHEC O157:H7的检测策略22-26

6.1 细菌分离法22

6.2 血清学检测策略22-23

6.3 免疫学检测策略23-24

6.4 分子生物学检测策略24-26

7 防控对策26-29

7.1 消灭传染源27

7.2 切断传播途径27

7.3 免疫预防27-29

探讨

一、分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立29-41

摘要29
ABSTRACT29-30
1 材料30-31

1.1 菌株30-31

1.2 动物和细胞株31

1.3 试剂31

1.4 仪器31

2 策略31-36

2.1 抗原的制备31

2.2 杂交瘤细胞株的建立31-36

3论文导读：-493讨论49-51探讨三大肠杆菌O157:H7人工感染小鼠排菌动态检测51-57摘要51ABSTRACT51-521材料与策略52-541.1材料52-531.2策略53-542结果54-552.1感染鼠的临床症状542.2感染鼠的排菌动态54-553讨论55-57全文总结57-58参考文献58-68致谢68-69攻读学位期间发表的学术论文目录69-70上一页12
结果36-39

3.1 杂交瘤细胞系的建立36-37

3.2 腹水纯化37

3.3 抗体效价37

3.4 类测定37-38

3.5 凝集试验38-39

4 讨论39-41
探讨

二、大肠杆菌O157:H7单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制41-51

摘要41
ABSTRACT41-42
1 材料与策略42-47

1.1 材料42-43

1.2 策略43-47

2 结果47-49

2.1 胶体金溶液的制备47

2.2 免疫胶体金的制备47

2.3 胶体金免疫层析试纸条的制备47-48

2.4 胶体金免疫层析检测试纸条成品检验48-49

3 讨论49-51
探讨

三、大肠杆菌O157:H7人工感染小鼠排菌动态检测51-57

摘要51
ABSTRACT51-52
1 材料与策略52-54

1.1 材料52-53

1.2 策略53-54

2 结果54-55

2.1 感染鼠的临床症状54

2.2 感染鼠的排菌动态54-55

3 讨论55-57
全文总结57-58
参考文献58-68
致谢68-69
攻读学位期间发表的学术论文目录69-70