试论基因HPV16/18E6/E7基因沉默对SiHa/HeLa细胞生物学行为影响信

论文导读：3）与对照组比较有显著性差别（P＜0.05）；⑤细胞周期检测结果表明E6/E7基因沉默后，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低；⑥检测顺铂作用48小时后细胞凋亡情况显示，转染后细胞总调亡率增加，表明E6/E7沉默使细胞对顺铂的敏感性增加；⑦hTERC基因检测发现E6/E7基因沉默使hTERC表达下调，正常细胞比例增加。

3.体内探讨：①E6/E7沉默能

摘要：目的高危型人瘤病毒(high risk human papillomirus，HR-HPV)的E6/E7是引起宫颈癌的主要致癌基因，在宫颈癌筛查与HPV治疗中具有重大的临床作用，目前E6/E7在宫颈癌致癌中机制尚不十分明确。本探讨目的在于通过观察E6/E7基因沉默对于宫颈癌细胞株生物学行为的影响，包括体外的增殖、凋亡、侵袭和裸鼠体内成瘤能力，同时观察E6/E7沉默后宫颈癌细胞对抗肿瘤药物顺铂耐受性的转变以及细胞内hTERC基因表达的变化，探讨HPV E6/E7在宫颈癌发生进展历程中的作用，并推测其发挥作用可能的分子机制，初步评价shRNA干扰对于HPV感染和抗肿瘤治疗领域的运用价值。策略1.shRNA质粒构建针对HPV16与HPV18E6/E7mRNA序列，分别设计3对shRNA特异性序列，构建shRNA载体共6对，利用电击转染法转染HPV16整合的SiHa细胞株与HPV18整合的HeLa细胞株，筛选出稳定转染的单细胞克隆细胞株（pSi-16-NC, pSi-16-1, pSi-16-2, pSi-16-3与pSi-18-NC, pSi-18-1, pSi-18-2, pSi-18-3）。2.体外探讨：①运用RT-PCR检测转染后24h、48h、72h，HPV16与HPV18E6与E7mRNA表达；②运用实时定量RT-PCR检测稳定转染细胞株中HPV16与HPV18E6与E7mRNA表达；③运用Western-blot检测转染后SiHa细胞和HeLa细胞中p53、pRb和p16抑癌蛋白的表达；④运用MTT测定转染后SiHa细胞和HeLa细胞的生长增殖能力；Transwell实验检测细胞迁移能力；流式细胞技术检测shRNA转染后SiHa细胞和HeLa细胞的周期分布；⑤顺铂作用48h后流式细胞技术检测细胞总凋亡与早、晚期凋亡；⑥运用FISH检测shRNA稳定转染后细胞内hTERC基因表达变化。3.体内探讨：运用SiHa细胞和HeLa细胞稳定转染细胞株分别建立裸鼠人宫颈癌模型（2×10~6个细胞/只）。①通过比较肿瘤体积和重量，观察E6/E7沉默对裸鼠肿瘤生长的抑制作用；②运用FISH检测shRNA转染后癌组织中hTERC基因表达变化。结果1. shRNA质粒的干扰作用：针对E6/E7设计的6组pSi-shRNA载体能够有效地抑制HPV16E6/E7mRNA与HPV18E6/E7mRNA的表达。抑制效果因选择的靶点位置不同而有着差别。在SiHa细胞中，pSi-16-1, pSi-16-2, pSi-16-3对E6和E7的抑制率分别为85.4%与54.9%；91.9%与63.2%；84.7%与71.1%。在HeLa细胞中，pSi-18-1, pSi-18-2, pSi-18-3对E6和E7的抑制率分别为91.3%与55.8%；90.4%与7.8%；87.2%与81.0%。2.体外探讨：①q RT-PCR结果显示，pSi-shRNA质粒能够有效沉默HPV16/18E6与E7mRNA的表达，见结果一；②转染前后SiHa细胞和HeLa细胞中p53、pRb和p16抑癌蛋白的表达均有上调；③M TT试验结果显示，E6/E7沉默使SiHa细胞和HeLa细胞的增殖活性降低，部分组（pSi-16-2, pSi-16-3, pSi-18-3）与对照组比较有显著性差别（P＜0.05）；④Transwell实验结果显示，E6/E7沉默使肿瘤细胞迁移能力下降,部分组（pSi-16-2, pSi-16-3, pSi-18-1, pSi-18-2, pSi-18-3）与对照组比较有显著性差别（P＜0.05）；⑤细胞周期检测结果表明E6/E7基因沉默后，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低；⑥检测顺铂作用48小时后细胞凋亡情况显示，转染后细胞总调亡率增加，表明E6/E7沉默使细胞对顺铂的敏感性增加；⑦h TERC基因检测发现E6/E7基因沉默使hTERC表达下调，正常细胞比例增加。3.体内探讨：①E6/E7沉默能抑制宫颈癌细胞的在裸鼠体内的生长，抑制裸鼠肿瘤的体积，与对照组比较有显著性差别（P＜0.01）；②E6/E7抑制降低了裸鼠体内肿瘤细胞hTERC基因的表达，使hTERC基因正常表达的细胞比例增加。结论重组质粒pSi-shRNA能够使E6/E7在论文导读：16/18E6/E7mRNA表达抑制对SiHa/HeLa细胞生长抑制作用的体内实验60-75实验目的60材料与策略60-61结果61-71讨论71-73参考文献73-74第三部分小结74-75全文总结75-76文献综述76-101综述一人瘤病毒与宫颈癌联系探讨进展76-84参考文献82-84综述二高危HPVE6\E7及相关基因在宫颈癌中致癌机制探讨进展84-92参考文献89-92
宫颈癌细胞株SiHa与HeLa细胞中的表达下调，其抑制率可达到60%~90%。E6/E7基因转录水平的沉默使宫颈癌细胞SiHa与HeLa细胞中抑癌蛋白p53、pRb、p16的表达增加，细胞生长受抑制，迁移能力降低，同时使处于G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少。综上表明E6/E7基因在宫颈癌细胞生长、增殖、迁移以及细胞周期调控等方面起着重要的作用，与肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关。顺铂药物实验表明E6/E7的抑制使宫颈癌细胞对顺铂敏感性增加，推动了细胞的凋亡。FISH技术检测E6/E7稳定抑制的细胞中hTERC基因的表达，发现E6/E7表达与hTERC基因扩增具有相关性。关键词：人瘤病毒论文RNA干扰论文E6基因论文E7基因论文肿瘤模型论文
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中文摘要8-10
Abstract10-12
前言12-16
参考文献13-16
第一部分：HPV16/18 E6/E7 shRNA真核表达载体对宫颈癌细胞E6/E7基因表达的抑制16-38
实验目的16
材料与策略16-25
实验结果25-32
讨论32-36
参考文献36-37
第一部分 小结37-38
第二部分：RNAi抑制E6/E7基因的表达对宫颈癌细胞生物学特性的影响38-60
实验目的38
材料与策略38-44
结果44-53
讨论53-56
参考文献56-58
第二部分 小结58-60
第三部分：HPV16/18 E6/E7 mRNA表达抑制对SiHa/ HeLa细胞生长抑制作用的体内实验60-75
实验目的60
材料与策略60-61
结果61-71
讨论71-73
参考文献73-74
第三部分小结74-75
全文总结75-76
文献综述76-101
综述

一、人瘤病毒与宫颈癌联系探讨进展76-84

参考文献82-84
综述

二、高危 HPV E6\E7 及相关基因在宫颈癌中致癌机制探讨进展84-92

参考文献89-92
综述

三、RNAi 技术在宫颈癌探讨中的运用92-101

参考文献97-101
博士期间发表的论文101-102
致谢102-103