探究淋巴细胞microRNA在慢性淋巴细胞白血病凋亡抑制通路中作用结论

论文导读：RNA，以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释，分别作Dicer，Drosha及内参β-actin的标准曲线并计算扩增效率，运用运用StratageneMx30012下一页
摘要：第一部分慢性淋巴细胞白血病microRNA表达谱芯片筛选及验证目的：探讨证实microRNA(miRNA)与慢性淋巴细胞白血病(CLL)发生进展密切相关，起类似于抑癌基因和癌基因的功能。本探讨通过miRNA表达谱芯片筛选在CLL细胞及正常B细胞差别表达的miRNA，并运用实时定量PCR(RQ-PCR)进行验证，并探讨CLL中部分miRNA的表达及预后作用。策略：运用Agilent miRNA芯片对来自6例CLL患者的CD19+肿瘤细胞及30例正常人外周血的淋巴细胞进行miRNA表达差别筛选；提取156例CLL患者外周血标本总RNA，以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释，分别作miRNAs及内参U6RNA的标准曲线并计算扩增效率，设计stem-loop茎环逆转录引物，运用ABI7300定量PCR仪定量检测，采取SYBR Green荧光染料法，循环阈值(Ct)比较法对miRNA表达行相对定量浅析，检测CLL细胞miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181a及miR-181b的表达水平；采取PCR联合DNA序列测定p53突变和免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变；运用间期荧光原位杂交(FISH)技术检测患者细胞遗传学异常；多色流式细胞术分别检测CLL细胞CD38和ZAP-70表达。浅析目的miRNA表达及与上面陈述的预后指标(细胞遗传学异常，IGHV状态，ZAP-70，CD38等预后因素)的联系。结果：miRNA芯片筛选出一系列在CLL及正常对照差别表达的miRNAs(显著上调的包括miR-29a、miR-660、miR-20a、miR-106b、miR-142-5p、miR-101、miR-30b、miR-34a、miR-let-7f、miR-21、miR-155等，显著下调的包括miR-126、 miR-572、miR-494、miR-923、miR-638、miR-130a、miR-181a、miR-181b等)；运用RQ-PCR定量发现CLL患者miR-15a、miR-16-1、miR-29b、miR-181a、miR-181b的表达均有不同程度下降。其中，miR-15a/miR-16-1下调与染色体13q14缺失显著相关，miR-29b低表达与IGHV无突变状态显著相关，miR-181a/b低表达与IGHV无突变、CD38阳性、p53缺失和/或突变均显著相关，且与CLL患者总体存活率(OS)及无治疗存活期(TFS)缩短均显著相关。结论：CLL细胞与正常B细胞miRNA表达谱有着显著差别，这些差别表达的miRNA可能参与了CLL的发病机制并与临床预后相关，其中miR-181a/b在CLL表达显著降低且与预后密切相关，可作为后期探讨目标。第二部分miR-181s在慢性淋巴细胞白血病凋亡抑制通路中的功能探讨目的：部分CLL患者有着p53通路异常，对治疗反应差，并与p53下游BCL-2、TCL-1、MCL-1等原癌蛋白的上调相关。本探讨旨在探讨miR-181s在慢性淋巴细胞白血病p53肿瘤抑制通路中的作用。策略：生物信息学策略候选出可能受miR-181s调控，且在CLL显著高表达的抗凋亡基因；构建双荧光素酶报告基因载体，分别构建含有靶基因BCL-2、MCL-1、XIAP3’UTR区的质粒，分别与miR-181a/b mimic、anti-miR-181a/b inhibitor、control mimic共转染耐药细胞株，进行荧光素酶实验鉴定miR-181a/b的靶分子；于CLL原代细胞，分别转染miR-181a、miR-181b及control mimics，用WesternBlot于蛋白水平检测靶基因在转染前后表达变化。40例CLL原代细胞，分别转染miR-15a、miR-16-1、miR-34a、miR-181a、miR-181b mimics后予氟达拉滨处理，培养48小时后流式细胞仪Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率转变；PCR联合DNA序列测定p53基因突变，荧光原位杂交(FISH)技术检测40例患者p53及ATM基因缺失情况。结果：双荧光素酶报告实验显示miR-181a/b对BCL-2，MCL-1及XIAP均有显著抑制作用；western blot证实瞬时转染miR-181a/b模拟体后CLL原代细胞的BCL-2，MCL-1及XIAP蛋白表达较转染control组显著下调；40例CLL患者原代细胞，其中10例伴有p53基因缺失和/或突变，30例p53基因正常。流式凋亡检测显示在p53正常组，转染miR-34a、miR-181a、miR-181b mimics后均可显著增强CLL细胞对氟达拉滨的敏感性，而在p53缺陷组，转染各组miRNA后CLL细胞对氟达拉滨的敏感性无显著增加。结论：miR-181a/b低表达与CLL患者不良预后相关，在p53基因正常的CLL肿瘤细胞，恢复miR-181a/b的表达可通过直接负性调节BCL-2/MCL-1/XIAP原癌蛋白显著增强CLL细胞对氟达拉滨的敏感性，以而克服CLL细胞的继发性耐药。第三部分Dicer及Drosha表达在慢性淋巴细胞白血病预后作用探讨目的：Dicer及Drosha是成熟miRNA形成历程中的关键剪切酶，其异常表达可致miRNA表达的广泛失调。本探讨通过实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测慢性淋巴细胞白血病患者Dicer及Drosha的表达，探讨CLL中Dicer及Drosha的表达及其与其他临床指标(包括临床分期，细胞遗传学异常，IGHV突变状态、ZAP-70、CD38、p53基因异常等因素)间的联系，首次探讨了其在CLL中的预后作用。策略：提取165例CLL患者骨髓或外周血标本，8例单克隆B淋巴细胞增加(MBL)患者及10名健康对照外周血B细胞总RNA，以cDNA为模板进行10倍梯度系列稀释，分别作Dicer，Drosha及内参β-actin的标准曲线并计算扩增效率，运用运用Stratagene Mx300论文导读：文献60-64第三部分Dicer及Drosha表达在慢性淋巴细胞白血病的预后作用探讨64-811.材料与策略65-662.结果66-744.讨论74-77参考文献77-81全文小结81-83综述83-99参考文献93-99附录1英文缩写表99-101附录2攻读学位期间发表论文情况101-102致谢102上一页12
0P定量PCR仪进行定量检测，采取SYBR Green荧光染料法，循环阈值(Ct)比较法对Dicer、Drosha表达行相对定量浅析。同时运用荧光原位杂交技术(FISH)检测CLL患者细胞遗传学异常，流式细胞仪检测CD38及ZAP70表达，多重PCR技术检测IGHV突变状态及p53基因突变状态。结果：临床分期较早(Binet A期)的患者Dicer表达水平高于临床分期较晚(BinetB+C期)的患者(mean±SD，0.017±0.010vs.0.015±0.019；p=0.001)。Dicer表达在MBL患者及正常对照B细胞中无显著差别(mean±SD，0.020±0.012vs0.019±0.09)。伴IGHV基因无突变、CD38表达阳性、ZAP-70表达阳性及p53异常(包括ATM缺失、p53缺失及突变)的患者，Dicer表达水平显著低于无以上不良预后因素者，差别显著(p值分别为p0.0001、p=0.0304、p=0.0075和p=0.011)。Dicer表达水平在伴有单独13q14缺失的患者显著高于其他核型的患者(p=0.0009)。以IGHV突变情况作为标准对Dicer表达水平做ROC曲线浅析确定其最佳分界值为0.012(AUC=0.7241，p0.0001)，Dicer低表达组总存活率显著低于Dicer高表达组(分别为132个月及未到达，p=0.0046)，Dicer低表达组的无治疗存活期亦显著低于Dicer高表达组(分别为24个月及110个月，p=0.0006)。Drosha表达在以上各组间未发现显著差别，未见显著预后作用。结论：Dicer表达水平与CLL重要预后因素IGHV基因突变、ZAP-70、CD38、p53状态密切相关，在CLL的预后中具有重要价值。关键词：microRNA论文慢性淋巴细胞白血病论文miRNA表达谱论文microRNA论文miR-181a/b论文BCL-2论文MCL-1论文XIAP论文慢性淋巴细胞白血病论文Dicer论文Drosha论文
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Abstract9-14
引言14-21
参考文献17-21
第一部分 慢性淋巴细胞白血病microRNA表达芯片筛选及验证21-42

1. 主要材料和仪器22-29

2. 结果29

3. 实验结果29-37

4. 讨论37-39

参考文献39-42
第二部分 miR-181 在慢性淋巴细胞白血病肿瘤抑制通路中的功能探讨42-64

1. 主要材料和仪器43-45

2. 实验策略45-51

3. 实验结果51-56

4. 讨论56-60

参考文献60-64
第三部分 Dicer 及 Drosha 表达在慢性淋巴细胞白血病的预后作用探讨64-81

1. 材料与策略65-66

2. 结果66-74

4. 讨论74-77

参考文献77-81
全文小结81-83
综述83-99
参考文献93-99
附录 1 英文缩写表99-101
附录 2 攻读学位期间发表论文情况101-102
致谢102