阐述凋亡RIP2调控NF-kB通路推动B-NHL细胞抗凋亡作用机制

论文导读：
摘要：B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin's lymphoma B-cell, B-NHL)是常见的来源于B淋巴细胞的恶性肿瘤。虽然不断更新的综合治疗案例已显著提升了该病的疗效,但对于侵袭性B-NHL的疗效甚微,目前仍有约40%的患者死于复发和治疗抵抗。探讨表明B-NHL细胞膜上BAFF受体(BAFF-R)所介导的非经典(替代型)和经典NF-κB通路活化与B-NHL细胞抗凋亡密切相关,影响B-NHL的进程、预后和治疗。由此,揭示非经典和经典NF-κB通路活化所介导的B-NHL细胞抗凋亡的机制探讨,有可能为B-NHL的分子诊断及特异的靶向药物探讨提供重要信息。受体相互作用蛋白2(Receptor-Interacting protein2, RIP2)具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性,属于RIP家族成员。探讨显示,RIP2在人组织中表达广泛,并且对其在多种细胞株中的表达浅析发现,RIP2在B-NHL细胞株Raji细胞中呈现高表达,提示RIP2可能对B-NHL细胞存活起到重要作用。而本室前期探讨发现RIP2在B-NHL患者外周血白细胞和耐药组织标本中呈现高表达,则进步提示RIP2与B-NHL细胞抗凋亡密切相关。此外,已有探讨发现RIP家族成员RIP1负调控TNFR1介导的非经典NF-κB通路激活；而非经典NF-KB通路激活依赖于核因子KB诱导激酶(nuclear factor KB-inducing kinase, NIK)的积聚,NIK显性负突变体可抑制RIP2对NF-κB转录激活,这些资料提示RIP2可能参与非经典NF-κB通路调控。非经典NF-κB通路激活主要通过TNF受体超家族成员CD40、LT-βR和BAFF-R介导信号,而呈跨膜表达的BAFF-R其胞内部分仅含有一个TRAF (TNF Receptor-Associated Factor,肿瘤坏死因子受体相关因子)结合位点,该位点只与接头分子TRAF3发生特异结合,TRAF3作为非经典NF-κB通路中BAFF-R唯一的接头分子,具有负调控NIK的作用,并且近期探讨发现抑制TRAF3引起非经典和经典NF-κB通路的共同激活。结合本室前期探讨发现,RIP2与TRAF3有着相互作用,进一步提示RIP2可能通过TRAF3参与BAFF-R介导的非经典和经典NF-κB通路的调控,但目前RIP2在B-NHL中对非经典和经典NF-κB通路的影响及调控B-NHL细胞抗凋亡的作用机制尚不清楚。我们首先获得高纯度的RIP2融合蛋白,直接观察RIP2在体外对肿瘤细胞增殖、存活和凋亡作用的影响。已有文献报道过表达RIP2可推动人乳腺癌MCF-7细胞凋亡、抑制细胞增殖。我们探讨显示RIP2融合蛋白剂量依赖性地抑制MCF-7细胞生长,表明我们获得的RIP2融合蛋白具有生物学活性。然而,RIP2融合蛋白对B-NHL细胞株Ramos细胞和胶质母细胞瘤细胞株U87MG却具有显著的促增殖作用,提示RIP2作用的细胞特异性。进一步结果显示,RIP2的体外细胞特异性作用与其调控抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达相关。随后,我们浅析了RIP2促B-NHL细胞抗凋亡的作用机制。在原有工作基础上,我们先验证了RIP2与TRAF3的相互作用并浅析相互作用区域。免疫共沉淀、GST pull-down实验证实RIP2与TRAF3在体内、外有着特异的相互作用。过表达RIP2可诱导NF-κB激活,我们通过NF-κB报告基因浅析,观察到TRAF3对RIP2诱导的NF-KB转录激活具有显著地抑制作用,并呈剂量依赖性。通过哺乳动物细胞双杂交策略筛选了RIP2上与TRAF3作用的分子结合域。结果显示,RIP2通过其中间域390-435aa与TRAF3-C末端发生相互作用。TRAF3是BAFF-R唯一的接头分子,负调控NIK参与非经典NF-κB通路调控。我们的探讨证实RIP2与TRAF3具有特异性相互作用,提示RIP2可能通过TRAF3参与非经典NF-KB通路的调控。进一步我们探讨了RIP2对BAFF-R介导的非经典NF-κB通路的调控机制。结果显示,敲低Ramos细胞中内源性RIP2表达,下调NIK激酶表达并抑制p100活化,表明RIP2参与BAFF-R介导的非经典NF-κBB通路的激活,并可能作为正调控子在非经典NF-κB通路中发挥重要作用。探讨证实NIK表达增加又可推动IKK复合物活性,以而进一步激活经典NF-KB通路。由此,我们观察了RIP2在Ramos细胞中抑制NIK表达是否亦影响NIK对经典NF-KB通路的激活。结果显示,单独敲低NIK可抑制IKBα和p65的磷酸化水平,而单独敲低RIP2没有此作用,但是在敲低NIK表达的基础上敲低RIP2表达,可进一步抑制了IκBα(S32)和p65(S536)的磷酸化水平,提示在BAFF-R介导的经典NF-κB信号通路,RIP2和NIK可能有着协同调控作用。无论经典或是非经典NF-KB通路都介导细胞的炎症反应,影响促炎细胞因子的表达。而炎症因子在B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的发生、进展中起着重要作用。由此我们观察了RIP2对NF-κB通路的正调控作用是否影响炎症相关因子的表达。结果显示在Ramos细胞中,敲低RIP2表达在mRNA水平下调TNFα和ICAM-1表达,ELISA结果亦显示RIP2敲低降低细胞上清中TNFα和可溶性ICAM-1(sICAM-1)分泌水平。上面陈述的结果提示RIP2可能参与NF-κB介导的炎症反应。此外,NF-κB通路活化介导细胞抗凋亡作用,推动细胞存活。在本探讨中,我们亦观察了RIP2对抗凋亡蛋白表达的调控作用。结果显示,敲低RIP2推动Ramos细胞凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-xL表达亦显著下调。并且在敲低NIK表达的基础上敲低RIP2表达,进一步推动Ramos细胞凋亡,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xL表达。以上结果表明,RIP2在B-N]HL细胞抗凋亡中发挥重要作用,亦提示RIP2调控非经典和经典NF-κB通路影响B-NHL细论文导读：IP2表达与利妥昔单抗共作用,进一步推动Ramos细胞凋亡,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xL表达。以上结果提示RIP2可能是B细胞性非霍奇金淋巴瘤中NF-κB通路活化的潜在治疗靶点,通过降低B-NHL细胞中RIP2蛋白表达与利妥昔单抗共作用可以改善利妥昔单抗单药作用的疗效,增加利妥昔单抗对B-NHL细胞诱导凋亡作用。综上所述,本探讨证实RIP2与TRAF
胞抗凋亡作用的分子机制。此外,本室另一探讨发现B-NHL患者组织标本中RIP2表达水平升高与非经典NF-κB信号通路的活化密切相关；且在利妥昔单抗(抗CD20抗体,CD20阳性B-NHL患者治疗的一线用药)耐药患者组织标本中RIP2表达水平显著升高,与非耐药组相比具有显著性差别。本探讨已经揭示RIP2参与BAFF-R介导的非经典NF-κB通路的活化,并与B-NHL细胞抗凋亡密切相关。由此我们推测,耐药患者B-NHL细胞RIP2的高表达可能在利妥昔单抗耐药中发挥重要作用。为此,我们进一步观察了RIP2在利妥昔单抗诱导B-NHL细胞凋亡中的作用并探讨了可能的作用机制。初步结果表明,与利妥昔单抗单独作用相比,在Ramos细胞中,敲低RIP2表达基础上加入利妥昔单抗可显著抑制NIK激酶的表达和p100的活化,在共敲低RIP2和NIK的基础上,加入利妥昔单抗可影响经典NF-κB通路中IκBα (S32)和p65(S536)的磷酸化水平和p65的表达。提示降低Ramos细胞内源RIP2表达可增加利妥昔单抗对BAFF-R介导的非经血NF-κB通路的抑制作用,而联合敲低NIK表达又可增强利妥昔单抗对经典NF-κB通路的活化的抑制作用。炎性细胞因子诱导和抗凋亡蛋白表达浅析结果也表明,敲低RIP2能推动利妥昔单抗对炎症因子TNFa和ICAM-1蛋白表达的拮抗作用,并且显著增强单药对Bcl-xL表达的抑制作用。同时结果显示,敲低RIP2表达与利妥昔单抗共作用显著诱导了Ramos细胞凋亡。并且在敲低NIK表达的基础上敲低RIP2表达与利妥昔单抗共作用,进一步推动Ramos细胞凋亡,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xL表达。以上结果提示RIP2可能是B细胞性非霍奇金淋巴瘤中NF-κB通路活化的潜在治疗靶点,通过降低B-NHL细胞中RIP2蛋白表达与利妥昔单抗共作用可以改善利妥昔单抗单药作用的疗效,增加利妥昔单抗对B-NHL细胞诱导凋亡作用。综上所述,本探讨证实RIP2与TRAF3在体内外有着特异的相互作用,并揭示RIP2通过TRAF3参与BAFF-R介导的非经典NF-κB通路的活化及可能协同NIK调控经典NF-κB通路,以而在B-NHL细胞中,参与NF-κB介导的抗凋亡作用及炎症反应。初步探讨也显示RIP2参与的经典或非经典NF-κB通路的调控作用可影响利妥昔单抗对B-NHL细胞的治疗作用。以上探讨结果为深入理解B-NHL细胞抗凋亡作用机制和B-NHL临床治疗提供了重要线索。关键词：B-NHL论文RIP2论文BAFF论文NF-κB论文抗凋亡论文TNFα论文ICAM-1论文
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摘要7-10
英文摘要10-15
前言15-19
第一部分 hRIP2的克隆、表达纯化和功能探讨19-35

一、hRIP2基因的钓取和重组表达载体的构建19-24

1. 材料与策略19-22

2. 结果22-24

二、hRIP2在大肠杆菌中的表达、纯化24-27

1. 材料与策略24-25

2. 结果25-27

三、rhRIP2的体外生物学活性探讨27-32

1. 材料与策略27-29

2. 结果29-32

讨论32-35
第二部分 RIP2与TRAF3相互作用验证35-57

一、RIP2与TRAF3在细胞内外相互作用验证35-48

1. 材料与策略35-41

2. 结果41-47

3 讨论47-48

二、RIP2上与TRAF3-C相互作用区域探讨48-57

1. 材料与策略49-52

2. 结果52-55

3 讨论55-57
第三部分 RIP2经BAFF-NF-κB通路对B-NHL细胞抗凋亡作用影响及调控机制探讨57-82

一、敲低RIP2对非经典NF-κB通路的影响57-66

1. 材料与策略57-60

2. 结果60-65

3. 讨论65-66

二、敲低RIP2对经典NF-κB通路的影响66-71

1. 材料与策略66-67

2. 结果67-70

3. 讨论70-71

三、敲低RIP2表达对B-NHL细胞炎性因子表达影响71-77

1. 材料与策略71-73

2. 结果73-76

3. 讨论76-77

四、敲低RIP2表达对B-NHL细胞抗凋亡影响77-82

1. 材料与策略77-78

2. 结果78-81

3. 讨论81-82

第四部分 敲低RIP2对利妥昔单抗作用B-NHL细胞的影响及机制探讨82-95

1. 材料与策略82-83

2. 结果83-92

讨论92-95
结论95-96
参考文献96-105
致谢105-106
个人简历106-108
文献综述108-116
参考文献113-116