浅论常温中度低温对大鼠脑缺血诱导脑组织炎症及外周免疫抑制效应及机制设计

论文导读：
摘要：背景与目的：缺血性脑卒中是世界上发病率最高的疾病之一。脑缺血后,不仅引起受损脑组织剧烈的炎症反应,亦诱发显著的外周免疫抑制。此外,脑卒中还可诱发肺脏、肝脏及心脏等多个脏器损伤。本探讨采取永久性大鼠局灶性脑缺血模型探讨缺血后脑组织的炎症反应,脑缺血诱导的免疫抑制及对外周脏器的损伤效应；同时,探讨作为强效缺血性脑损伤保护因素的中度低温对脑组织炎症反应、外周免疫抑制及外周器官损伤所产生的效应。策略：分别于37℃、30℃条件下夹闭Sprague Dawley (SD)大鼠双侧颈总动脉60分钟,电凝左侧大脑中动脉远端使其永久闭塞以建立大鼠局灶性脑缺血模型(dMCAo)。首先,对大鼠进行神经功能缺损评分,采取TTC染色测量脑梗塞大小其次,为了解脑缺血后脑组织局部炎症反应情况以及低温对炎症的效应,于脑缺血72小时后,提取脑单个核细胞,计算其总数。进而,采取流式细胞仪浅析单个核细胞中各种淋巴细胞亚型(T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、调节性T细胞、NK细胞及NKT细胞)以及SIRP+单核/巨噬细胞/小胶质细胞绝对数量的转变。之后,采取免疫组织化学进一步评估CD3+T淋巴细胞在缺血脑组织的浸润,而免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜则进一步检测了CD68+激活的小胶质细胞/巨噬细胞及MPO+中性粒细胞在脑缺血区的浸润与分布。接下来,实时定量RT-PCR检测脑缺血后5小时、24小时、72小时各种细胞因子(IL-11β、TNF-α、 IL-4、EL-10、IL-2、INF-γ).趋化因子(MIP-2)及其他炎症介质(INOS、COX-2)在脑组织缺血半暗带的基因表达水平(组别：正常对照组,假手术组,5、24、72小时常温脑缺血组及低温脑缺血组)。为探讨脑缺血诱导的外周免疫抑制,脑缺血对外周器官的损伤效应以及低温对免疫抑制和外周器官损伤所产生的作用,提取并计算外周血、肺脏单个核细胞及脾细胞总数,浅析这些组织和器官中淋巴细胞亚型及SIRP+单核/巨噬细胞绝对值的转变,实时定量RT-PCR检测脑缺血后5小时、24小时、72小时上面陈述的9种炎症介质在外周器官如：脾脏、肝脏以及肺脏中的基因表达水平。进而,为进一步证实脑缺血可以诱导免疫抑制以及阐明低温的效应,提取大鼠脾细胞,分别于1μg/ml,2.5μg/ml及5μg/ml ConA刺激之下于37℃5%CO2孵箱中孵育66小时,之后加入[3H]-Thymidine继续孵育18小时,收集细胞检测脾淋巴细胞增殖(组别：正常对照组,常温假手术组,低温假手术组,常温脑缺血组,低温脑缺血组)。同时,采取大鼠耳廓皮肤皮射OVA诱导DTH反应(迟发型超敏反应)作为在体实验来探讨脑缺血对细胞介导的免疫反应的效应及低温的影响(组别：正常对照组,常温假手术组,低温假手术组,常温脑缺血组,低温脑缺血组)。结果：永久性夹闭大脑中动脉远端后,大鼠神经功能缺损显著加重,评分超过3分,大鼠出现皮层梗塞,梗塞大小占皮层的百分比达47.36±3.195,而低温治疗组脑梗塞大小为皮层的20.33±3.362%。低温使梗塞显著减小,神经功能缺损显著改善,神经功能缺损评分仅为不到2分。脑缺血后,大量炎症细胞浸润于缺血脑组织,缺血72小时后,缺血侧单个核细胞总数为(0.483±0.0953)×106,相比对侧的(0.173±0.0177)×106,显著增加,其中T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及SIRP+单核/巨噬细胞/小胶质细胞数量也显著增加,而B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及NK、NKT细胞呈现增加的走势。免疫染色进一步证实脑缺血后,缺血脑组织CD3+T淋巴细胞、CD68+小胶质细胞/巨噬细胞及MPO+中性粒细胞显著增加。予以低温治疗后,脑组织中单个核细胞总数下降为(0.245±0.0185)×106,而T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞及SIRP+单核/巨噬细胞/小胶质细胞浸润数量也显著减少,缺血区CD3,CD68及MPO表达水平也显著降低。脑缺血后,脑组织缺血半暗带EL-1β, TNF-α IL-10、 IL-2、INF-γ、MIP-2、INOS的基因表达水平显著增高,而低温显著抑制了这些炎症介质的表达；IL-4及COX-2在缺血脑组织也有表达增高的走势,但低温对其没有显著影响。脑缺血后,外周血单个核细胞总数为(3.56±0.427)×106,相比常温假手术组的(5.95±0.449)×106,显著降低,而低温显著逆转了这种效应,低温脑缺血组单个核细胞为(4.55±0.488)×106。在血液中,T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及B淋巴细胞等亚型的绝对值在脑缺血后显著降低,低温对这些细胞数量的降低有衰减作用。在脾脏中,发现与血液相似的结果,脾细胞总数在常温假手术组为(245.91±22.595)×106,而脑缺血后显著降低为(140.94±18.270)×106,其中除T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及B淋巴细胞等亚型的绝对值显著降低外,其他如Treg、NK、NKT及B淋巴细胞数量也显著减少,而低温可以衰减所有这些细胞数量的减少,低温治疗后脑缺血组脾细胞总数升高为(206.94±32.699)×106。然而,脑缺血对肺脏单个核细胞总数及亚型并无显著影响,同样,低温也未产生显著效应。另外,脑缺血并未诱导外周器官脾脏,肺脏及肝脏中上面陈述的所检测的9种炎症介质基因表达水平发生显著转变,而低温对它们的表达也无显著效应。在1μg/ml、2.5μg/ml及5μg/ml ConA刺激下,常温假手术组与常温脑缺血组脾细胞增殖的CPM分别是63850±7185与18886±5360、48577±8552与22591±5853及31366±5252与10137±1824,说明脑缺血显著抑制了离体脾淋巴细胞的增殖,而低温脑缺血组在上面陈述的浓度ConA刺激下,脾细胞增殖CPM分别是40017±8418、40594±3131及21582±3435,与脑缺血组相比,低温论文导读：5插图和附表清单15-16缩略词表16-18目次18-19引言19-22第一部分脑缺血诱导脑组织炎症反应及低温效应的探讨22-44材料与策略22-30主要材料22-23主要策略23-30结果30-38讨论38-43结论43-44第二部分脑缺血诱导外周免疫抑制及低温对免疫抑制效应的探讨44-67材料与策略44-49主要材料44-45主要策略45-49结果49-59讨论59-66结论66
显著逆转了其对脾细胞增殖能力的抑制；同时,脑缺血显著抑制了OVA所诱导的DTH反应,常温假手术组与常温脑缺血组OVA注射侧耳廓厚度分别是1.391±0.0799与0.996±0.0051mm,而这种抑制效应却被低温显著衰减,低温脑缺血组耳廓厚度为1.077±0.0356mm。结论：本探讨进一步全面系统地证实脑缺血可以引起大脑剧烈的炎症反应,也进一步支持充实前人关于脑缺血诱导免疫抑制的观点；本探讨发现短暂性缺血期内中度低温可以显著改善脑缺血诱导的大脑炎症；而且,本探讨在世界上首次报导短暂性缺血期内中度低温不仅自身未诱导外周免疫抑制,而且亦未加重脑缺血诱导的免疫抑制,反而显著改善了这种免疫失功；本探讨还首次发现短暂性缺血期内中度低温未直接或与低温协同对外周器官造成损伤。这些发现为临床上缺血期内运用低温治疗提供了有力的支持。然而,本探讨中,脑缺血自身也并未诱导显著外周器官损伤,可能与采取的脑缺血模型有关。关键词：局灶性脑缺血论文常温论文低温论文炎症论文迟发性超敏反应(DTH)论文免疫抑制论文
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中文摘要7-11
Abstract11-15
插图和附表清单15-16
缩略词表16-18
目次18-19
引言19-22
第一部分 脑缺血诱导脑组织炎症反应及低温效应的探讨22-44
材料与策略22-30
主要材料22-23
主要策略23-30
结果30-38
讨论38-43
结论43-44
第二部分 脑缺血诱导外周免疫抑制及低温对免疫抑制效应的探讨44-67
材料与策略44-49
主要材料44-45
主要策略45-49
结果49-59
讨论59-66
结论66-67
参考文献67-75
综述75-96
参考文献87-96
作者简历及在学期间所取得的科研成果96-98
附录98-103