探索膜片雷帕霉素对颞叶癫痫齿状回兴奋性环路影响

论文导读：
摘要：第一部分：雷帕霉素抑制mTOR信号通路在匹罗卡品诱发颞叶癫痫小鼠海马组织中的激活目的：观察mTOR (mammapan target of rapamycin)信号通路在匹罗卡品诱发颞叶癫痫小鼠海马组织中的激活及雷帕霉素对mTOR信号通路的抑制作用。策略：6-8周成年健康雄性C57BL/6小鼠(体重20-25g),随机分为阴性对照组(n=20,注射生理盐水),阳性对照组(n=20,注射匹罗卡品),空载体组(n=20,注射匹罗卡品+载体),雷帕霉素干预组(n=20,注射匹罗卡品+雷帕霉素)。阳性对照组,空载体组及雷帕霉素干预组均采取东莨菪碱-匹罗卡品腹腔注射建立颞叶癫痫模型；阴性对照组注射等量无菌生理盐水。雷帕霉素干预组小鼠在东莨菪碱-匹罗卡品诱发癫痫持续状态后24h开始腹腔注射雷帕霉素(6mg/kg),第1周每天一次,之后隔天注射一次；空载体组按同样策略注射等剂量载体介质。各组在癫痫持续状态后或生理盐水注射后3d,5d,1w,2w,8w,用Western blot策略检测mTOR信号通路下游因子核糖体蛋白S6的表达(S6)及磷酸化(p-S6)。结果：1.mTOR信号通路在匹罗卡品诱发颞叶癫痫小鼠海马组织中的激活：阳性对照组小鼠海马组织p-S6/S6在癫痫持续状态后3d到5d较阴性对照组显著升高(one way ANOVO,P0.001),并在2周内维持在较高水平(one way ANOVO,P0.01),后逐渐下降,直到8周p-S6/S6仍显著高于阴性对照组(one way ANOVO,P0.01),提示mTOR信号通路在匹罗卡品诱发颞叶癫痫小鼠海马组织中持续慢性激活。2.雷帕霉素对mTOR信号通路的抑制作用：空载体组mTOR信号通路在癫痫持续状态后各时间点均显著激活；而雷帕霉素干预组小鼠海马组织p-S6/S6在各时间点均较空载体组显著下降(one way ANOVO,P0.01),提示雷帕霉素抑制匹罗卡品诱发颞叶癫痫海马组织中mTOR信号通路的激活。结论：mTOR信号通路在匹罗卡品诱发颞叶癫痫小鼠海马组织中持续慢性激活,雷帕霉素可抑制mTOR信号通路的激活。第二部分：雷帕霉素对颞叶癫痫小鼠齿状回兴奋性环路的影响目的：观察雷帕霉素抑制mTOR信号通路后对颞叶癫痫小鼠齿状回兴奋性环路主要特点的影响,包括颗粒细胞自发兴奋性突触后电流及逆向刺激苔藓纤维诱发的兴奋性突触后电流,及癫痫样发放的影响。策略：6-8周成年健康雄性C57BL/6小鼠(体重20-25g),随机分为阴性对照组(n=8,注射生理盐水),阳性对照组(n=8,注射匹罗卡品),空载体组(n=8,注射匹罗卡品+载体),雷帕霉素干预组(n=8,注射匹罗卡品+雷帕霉素)。各组建模同第一部分。在癫痫持续状态后或生理盐水注射后8周,取小鼠海马组织切片(300μm),用全细胞膜片钳记录齿状回颗粒细胞自发兴奋性突触后电流及逆向刺激苔藓纤维诱发的兴奋性突触后电流,用细胞外记录观察癫痫样发放。结果：1.雷帕霉素抑制颞叶癫痫齿状回颗粒细胞自发兴奋性突触后电流的幅度及频率：将齿状回颗粒细胞自发兴奋性突触后电流的幅度及频率进行累积频率分布统计后,结果显示阳性对照组齿状回颗粒细胞自发兴奋性突触后电流的幅度较阴性对照组升高(Kolmogorov-Smirnov two-sample test, P＜0.01),频率显著升高(Kolmogorov-Smirnov two-sample test, P0.001);雷帕霉素干预组齿状回颗粒细胞自发兴奋性突触后电流幅度较空载体组下降(Kolmogorov-Smirnov two-sample test, P0.05),频率显著下降(Kolmogorov-Smirnov two-sample test, P0.001)。2.雷帕霉素抑制颞叶癫痫逆向刺激苔藓纤维诱发齿状回颗粒细胞的兴奋性突触后电流：阳性对照组逆向刺激苔藓纤维诱发的齿状回颗粒细胞兴奋性突触后电流的幅度为141.7±17.9pA,而阴性对照组仅为38.9±3.9pA,阳性对照组较阴性对照组显著升高(one way ANOVO,P0.001)；雷帕霉素干预组逆向刺激苔藓纤维诱发齿状回颗粒细胞的兴奋性突触后电流的幅度为55.4±5.2pA,而空载体组为164.1±16.1pA,雷帕霉素干预组较空载体组显著降低(one way ANOVO, P0.001)。3.雷帕霉素抑制颞叶癫痫齿状回颗粒细胞癫痫样发放：细胞外记录观察齿状回颗粒细胞癫痫样发放。在正常的人工脑脊液中,所有组脑片均未体现出癫痫样发放；而在高钾及抑制GABAa通道的情况下,8只阴性对照组无癫痫样发放,8只阳性对照组中有3只小鼠体现出癫痫样发放(统计突触后场电位的个数显示两组间有着统计学差别,one way ANOVO, P0.01);8只空载体组中有2只小鼠体现出癫痫样发放,8只雷帕霉素干预组小鼠无癫痫样发放(统计突触后场电位的个数显示两组间有着统计学差别,one way ANOVO, P0.05)。结论：雷帕霉素抑制颞叶癫痫小鼠齿状回颗粒细胞自发兴奋性突触后电流的活性,逆向刺激苔藓纤维诱发的兴奋性突触后电流幅度及癫痫样发放,以而对齿状回兴奋性环路产生抑制作用。第三部分：雷帕霉素对颞叶癫痫小鼠齿状回内分子层苔藓纤维出芽的影响目的：观察雷帕霉素抑制mTOR通路激活后对齿状回内分子层苔藓纤维出芽的影响。策略：用于电生理记录的脑片经0.4%Na2S溶液浸泡15分钟,在4%多聚甲醛溶液中浸泡过夜,再用冰冻切片机切成30μm厚切片,行Timm染色,观察各组齿状回内分子层苔藓纤维出芽的情况。结果：雷帕霉素抑制颞叶癫痫齿状回内分子苔藓纤维出芽：阳性对照组在癫痫持续状态8周后,齿状回内分子层可见显著苔藓纤维出芽,尤其是体现出癫痫样发放的脑片苔藓纤维出芽更显著,阴性对照组在生理盐水注射8周后,齿状回内分子层未见苔藓纤维出芽(Timm评分,one way ANOVO,P0.01);雷帕霉素干预组在癫痫持续状态8周后,齿状回内分子层仅可论文导读：雷帕霉素对颞叶癫痫小鼠齿状回兴奋性环路的影响41-65材料与策略41-471、实验材料41-432、实验策略43-473、统计学浅析47实验结果47-56讨论56-64结论64-65第三部分雷帕霉素对颞叶癫痫小鼠齿状回内分子层苔藓纤维出芽的影响65-78材料与策略65-681、实验材料65-672、实验策略67-683、统计学浅析68实验结果68-70讨论70-77结论77
见少量苔藓纤维出芽,而空载体组在癫痫持续状态8周后,齿状回内分子层仍可见大量苔藓纤维出芽(Timm评分,one way ANOVO, P0.05)。结论：雷帕霉素抑制颞叶癫痫小鼠齿状回内分子层苔藓纤维出芽,可能是雷帕霉素抑制颞叶癫痫小鼠齿状回兴奋性环路的结构基础。关键词：颞叶癫痫论文膜片钳论文雷帕霉素论文齿状回论文C57BL/6小鼠论文
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Abstract8-15
主要英汉缩略语名词对照表15-16
前言16-20
第一部分 雷帕霉素抑制mTOR信号通路在匹罗卡品诱发颞叶癫痫小鼠海马组织中的激活20-41
材料与策略20-29

1、实验材料20-22

2、实验策略22-29

3、统计学浅析29

实验结果29-33
讨论33-40
结论40-41
第二部分 雷帕霉素对颞叶癫痫小鼠齿状回兴奋性环路的影响41-65
材料与策略41-47

1、实验材料41-43

2、实验策略43-47

3、统计学浅析47

实验结果47-56
讨论56-64
结论64-65
第三部分 雷帕霉素对颞叶癫痫小鼠齿状回内分子层苔藓纤维出芽的影响65-78
材料与策略65-68

1、实验材料65-67

2、实验策略67-68

3、统计学浅析68

实验结果68-70
讨论70-77
结论77-78
参考文献78-90
综述90-109
参考文献101-109
致谢109-110
攻读博士学位期间发表的论文110