阐释子宫内膜LPAR3对人类子宫内膜容受性调控

论文导读：
摘要：人类胚胎植入是一个十分复杂的历程,在这个历程中胚胎和子宫内膜互相作用,在一段非常短的时期共同作用完成胚胎着床。一个成功的植入历程需要三个重要的条件：优质的胚胎、良好的子宫内膜容受性以及胚胎和子宫内膜的同步发育。子宫内膜仅在一段十分短暂的时间内具有接受胚胎的能力,这一时期叫做“着床窗口期”。子宫内膜的容受性受到多种生物信号的调控,包括：特殊的生长因子、细胞因子、磷脂分子、细胞粘附因子以及转录因子等。这些生物信号受女性甾体激素、前列腺素和肽类激素的调节,它们的变化会造成子宫内膜容受性的转变,导致胚胎植入率和妊娠率的下降。溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid, LPA)是一种具有多生物效应的生长因子。它可以调控细胞的存活、增殖、分化、抑制细胞间的缝隙连接和转变细胞骨架的重新排列。LPA在生殖方面也起到了重要的调控作用,包括刺激卵子的成熟、调节2-4卵裂球的胚胎向囊胚的转化、影响胚胎在输卵管的运输。LPA主要依靠细胞外基质的溶血磷脂酶D水解磷脂生成,也可以由活化的血小板、红细胞、有丝分裂后的神经元细胞、卵巢和宫颈癌细胞、脂肪细胞和肥大细胞分泌产生。LPA通过G偶联蛋白受体LPAR1-4发挥生物学效应。敲除LPAR1和LPAR2的雌性小鼠生育能力正常,但是敲除LPAR3基因的雌性小鼠生育能力发生转变,主要体现为胚胎植入空间的转变、胚胎缠绕以及种植时间延迟。在小鼠交配后的2.5d,小鼠子宫内膜上LPAR3的表达开始上升,在围植入期即交配后的3.5d表达达到顶峰,然后在交配后4.5d下降恢复到基础水平直至分娩后。目前对LPAR3在人类子宫内膜容受性方面的探讨很少,仅仅知道反复植入失败的患者和子宫内膜异位症的患者在他们月经周期的分泌期LPAR3在其子宫内膜上的表达较正常妇女低。在制约性超促排卵(Controlled ovarian hyperstimulation, COH)中,由于为了在一个促排卵周期中同时得到多个发育的成熟卵子,因而利用了大量的促排卵药物。长效长案例是目前运用的较多的一种促排卵案例,该案例可以获得优质的卵子,受精率和优胚率都比较高,但是胚胎的植入率比较低。浅析理由,多数学者认为是由于促排卵药物的利用造成体内产生超生理浓度的激素,以而干扰了子宫内膜的内环境,降低了子宫内膜的容受性。由此,找到子宫内膜容受性下降的理由并找到解决的策略,可以提升IVF的妊娠率,具有很好的临床作用。至今,还没有文献报道人类长案例促排卵的患者子宫内膜上LPAR3的表达方式。多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)患者由于体内内分泌紊乱,造成雌孕激素分泌异常和促黄体生成素(LH)的升高,导致子宫内膜上影响子宫内膜容受性的因素表达异常,以而降低了PCOS患者子宫内膜的容受性。目前对PCOS患者的子宫内膜容受性的探讨主要集中在对甾体激素及其受体、整合素、基质金属蛋白酶、同源框基因等因子,对于目前新近发现在生殖历程中发挥重要作用的LPAR3的探讨甚少,国内外均未见报道。此外在我们探讨的临床部分,我们在改善PCOS患者子宫内膜容受性的原理的基础上,采取了降调节人工周期子宫内膜准备的策略,目的是找到一种有效的提升PCOS患者的子宫内膜的容受性的策略。本探讨主要利用RT-PCR, Western blot和免疫组化等技术探讨了正常妇女月经周期、IVF促排卵患者围着床期以及PCOS患者月经周期中子宫内膜LPAR3的表达情况和差别。初步说明了LPAR3在子宫内膜容受性建立历程中的重要作用。探讨分为四个部分,前三个部分为实验部分,最后一个部分为临床部分,实验策略和结果如下：第一部分LPAR3在正常妇女月经周期子宫内膜上的表达目的：探讨溶血磷脂酸受体3(Lysophosphatidic acid receptor3,LPAR3) mRNA及其蛋白在正常妇女月经周期中子宫内膜上的表达规律。策略：采取RT-PCR, Western blot和免疫组化法,检测LPAR3mRNA和蛋白在正常妇女月经周期中子宫内膜上的表达规律。结果：1.在整个人类月经周期中均可在子宫内膜组织中检测到LPAR3mRNA和蛋白的表达。2.在整个增生期LPAR3mRNA和蛋白的表达呈低表达状态,在早分泌期LPAR3mRNA和蛋白表达显著升高,并且达到峰值,但是在中分泌期LPAR3mRNA和蛋白的表达骤然下降,恢复到增生期水平。但在晚分泌期LPAR3mRNA和蛋白表达又上升,逐级恢复到早分泌期水平。3.在早增生期LPAR3蛋白主要分布在子宫内膜的腔上皮、腺上皮的细胞浆中。在中晚增生期虽然间质细胞的细胞浆中LPAR3的阳性着色范围扩大,但仍是主要在子宫内膜的腺上皮和腔上皮细胞的胞浆中呈阳性表达。在早分泌期腺上皮和子宫内膜腔上皮细胞呈强阳性免疫染色,间质细胞也出现强阳性反应。在中分泌期LPAR3在子宫内膜间质细胞和上皮细胞的表达骤然下降,主要表达在子宫内膜腔上皮的细胞浆中,但是表达降低呈弱阳性反应。在晚分泌期LPAR3王要在子宫内膜间质细胞中和血管上表达,呈强阳性反应。在子宫内膜的腔上皮和腺上皮上呈弱阳性表达。4.在早中增生期主要分泌雌激素(estrogen, E), LPAR3处于低表达状态；在晚增生期成熟卵泡的颗粒细胞在黄体生成素(luteinizinghormone, LH)排卵高峰的作用下,开始分泌孕酮(progestin,P),排卵后P逐渐增加,E分泌下降,子宫内膜上LPAR3的表达开始在早分泌期增加。在中分泌期E水平又增加,LPAR3在子宫内膜上的表达下降。在晚分泌期E水平下降,LPAR3在子宫内膜上的表达开始上升结论：1. LPAR3在人类月经周期中子宫内膜上呈周期性的变化,在人类的围着床期LPAR3的表达达到顶峰,这种变化规律揭示LPAR3可能参与了子宫内膜容受性的建立,可作为预测子宫内膜容受性的分子参考指标。2.我们把月经周期中E、LH和P的表达规律和LPAR3在子宫内膜上的表达方式相比较,我们推测LPAR3论文导读：
可能受到LH和P的正向调控,而E可能对这种正向调控有抑制作用(见下图)。第二部分GnRHa长案例促排卵对围着床期人类子宫内膜上LPAR3表达的影响目的：探讨GnRHa/rFSH/hCG制约性超促排卵(COH)对围着床期人类子宫内膜溶血磷脂酸受体3(LPAR3)表达的影响。策略：将探讨对象分为自然周期对照组(NC组)和COH实验组,用RT-RCR和Western blot策略观察两组排卵后3d～6d子宫内膜上LPAR3mRNA和蛋白的表达变化。结果：1.NC组子宫内膜中LPAR3的表达在排卵后d4达到顶峰,COH组子宫内膜LPAR3的表达高峰较NC组要提前1d,即在排卵后d3达到顶峰。2.COH组子宫内膜LPAR3在各时间点的表达水平均低于对照组,有统计学差别(P0.05)。3.COH组血清中E2和P浓度水平在相应各时间点均高于NC对照组,E2/P比值也高于NC对照组,有统计学差别(P0.05)。结论：1. GnRHa制约性超促排卵可能通过转变子宫内膜LPAR3表达的水平和时序变化,一方面降低了子宫内膜的容受性,同时一方面也使子宫内膜与胚胎发育不同步以而降低胚胎的着床率。这提示我们可能通过改善目前移植胚胎的时间,达到子宫内膜和胚胎发育同步,以而提升IVF妊娠率。2.可能由于在GnRHa制约性超促排卵中超生理剂量的E2和P水平,以及不协调的E2/P比造成了LPAR3表达的异常。我们可能通过调节E2/P比值,使LPAR3的表达恢复正常状态,提升IVF妊娠率。第三部分LPAR3在PCOS患者月经周期子宫内膜上的表达目的：探讨溶血磷脂酸受体3(Lysophosphatidic acid receptor3,LPAR3) mRNA及其蛋白在PCOS月经稀发患者月经周期中子宫内膜上的表达。策略：采取RT-PCR, Western blot策略,检测LPAR3mRNA和蛋白在PCOS月经稀发患者月经周期中子宫内膜上的表达。结果：1.PCOS组患者月经周期天数为39.75天,显著多于NC对照组月经周期天数30.5天(P0.01)。在增殖期PCOS组血清中LH水平为8.61miu/ml,高于NC组增殖期血清中LH水平3.10miu/ml,有统计学差别(P0.01)。在早、中分泌期PCOS组患者血清中P水平1.64ng/ml、6.36ng/ml,显著低于NC组P水平4.46ng/ml、14.2ng/ml,有统计学差别(P0.05)。2. PCOS组在整个增生期LPAR3mRNA和蛋白在子宫内膜上呈低表达状态,但与NC对照组增生期相比要高于NC对照组,有统计学差别。在早分泌期LPA3mRNA和蛋白表达显著升高,并且达到峰值,在中分泌期LPAR3mRNA和蛋白的表达骤然下降,恢复到增生期水平。PCOS组中LPAR3mRNA和蛋白水平在早分泌期子宫内膜上的表达要显著低于NC对照组,有统计学差别(见下图)。结论：1.PCOS组中增生期LPAR3的异常表达可能和PCOS患者子宫内膜过度增殖相关。2.PCOS组中在早分泌期即围着床期LPAR3的表达较NC对照组低,这可能干扰了其子宫内膜容受性的建立,降低了子宫内膜的容受性3. PCOS组在增生期血清中LH水平的高表达以及在分泌期P的低表达状态可能和其子宫内膜上LPAR3异常表达相关。第四部分两种雌孕激素替代法内膜准备对多囊卵巢综合症冷冻胚胎移植临床效果的比较目的：比较非降调节雌孕激素替代法与降调节雌孕激素替代法作为子宫内膜准备策略对多囊卵巢综合症患者(PCOS)冻融胚胎移植(FET)的妊娠结局。策略：在PCOS患者FET周期中,分别采取非降调节雌孕激素替代法(GnRHa组,n=89)、降调节雌孕激素替代法(HRT组,n=37)准备内膜,比较周期妊娠率、种植率、流产率、宫外孕发生率等指标。结果：1.HRT组和GnRHa组2组患者年龄分别为29.53±3.39岁、29.24+2.85岁(P0.05);基础体重指数分别为23.07±3.51、22.20+2.96(P0.05)；不孕年限分别为3.14±1.89年、3.86+136年(P0.05);2.在黄体支持日HRT组和GnRHa组2组患者E水平分别为189.72±110.88pg/ml、133.08±55.3g/ml (P0.05); LH水平分别为11.74±6.49miu/ml、1.3±0.67miu/ml (P0.01)。3.2组移植周期临床妊娠率为55.06%、72.9%(P0.05)；种植率分别为38.7%、53.6%(P0.05)；流产率分别为16.3%、14.8%(P0.05);宫外孕率分别为4.1%、3.7%(P0.05)。结论：对于PCOS患者利用降调节雌孕激素替代法可能改善子宫内膜的容受性,是一种合适的子宫内膜准备案例。关键词：溶血磷脂酸受体3论文月经周期论文子宫内膜容受性论文制约性超排卵论文LPAR3论文子宫内膜容受性论文PCOS论文子宫内膜容受性论文LPAR3论文冷冻胚胎移植论文降调节论文替代周期论文PCOS论文妊娠率论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要4-13
ABSTRACT13-23
符号说明23-25
前言25-29
第一章 材料和策略29-49

1.1 实验材料29-34

1.1 探讨对象及其一般资料29-32

1.2 RT-RCR引物合成32

1.3 主要抗体32

1.4 主要试剂/试剂盒32-33

1.5 主要设备和仪器33-34

1.2 策略34-49

1.2.1 子宫内膜的采集34

1.2.2 RT-PCR34-37

1.2.3 免疫组化37-41

1.2.4 Western blotting41-49

第二章 实验结果49-61
2.1 LPAR3基因在人类月经周期中子宫内膜组织上的表达4论文导读：.1LPAR3在正常妇女月经周期中子宫内膜上的表达61-643.2GNRHA长案例促超排卵对围着床期人类子宫内膜LPAR3表达的影响64-663.3LPARCOS患者月经周期中子宫内膜上的表达66-693.4降调节雌孕激素替代法准备内膜对PCOS患者冻融胚眙移植周期子宫内膜容受性的影响69-73结论73-74参考文献74-82综述82-100参考文献93-100致谢100-
9-53
2.

1.1 LPAR3 mRNA在人类月经周期中子宫内膜组织上的表达49-50

2.

1.2 LPAR3蛋白在人类月经周期中子宫内膜组织上的表达50-51

2.

1.3 LPAR3蛋白在人类月经周期中子宫内膜组织上的表达定位51-53

2.2 GNRHA长案例促超排卵对围着床期人类子宫内膜LPAR3表达的影响53-56

2.1 LPAR3 mRNA在NC组和COH组围着床期子宫内膜上的表达53-54

2.2.2 LPAR3蛋白在NC组和COH组围着床期子宫内膜上的表达(图2-6)54-55

2.3 NC组和COH组各时期雌、孕激素水平和雌/孕比值(表2-5)55-56

2.3 PCOS患者增殖期、早、中分泌期人类子宫内膜上LPAR3的表达56-59

2.3.1 LPAR3 mRNA在NC组和PCOS组子宫内膜上的表达(表2-6)56-58

2.3.2 LPAR3蛋白在NC组和PCOS组子宫内膜上的表达58

2.3.3 两组月经周期天数、基础LH值和在各个时期血清中雌二醇、孕激素的水平(表2-8)58-59
2.4 两种雌孕激素替代法内膜准备对多囊卵巢综合症冷冻胚胎移植妊娠率的影响59-61
第三章 讨论61-73

3.1 LPAR3在正常妇女月经周期中子宫内膜上的表达61-64

3.2 GNRHA长案例促超排卵对围着床期人类子宫内膜LPAR3表达的影响64-66

3.3 LPAR3 PCOS患者月经周期中子宫内膜上的表达66-69

3.4 降调节雌孕激素替代法准备内膜对PCOS患者冻融胚眙移植周期子宫内膜容受性的影响69-73
结论73-74
参考文献74-82
综述82-100
参考文献93-100
致谢100-101
攻读学位期间主要的探讨成果目录及附件101