探讨受体UT受体拮抗剂-urantide抗大鼠心肌缺血再灌注损伤作用及其机制

论文导读：调UT受体表达，在心肌细胞缺氧再给氧模型基础上，探讨urantide对缺氧再给氧心肌细胞保护作用与UT受体之间的联系。第一部分Urantide对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及相关机制探讨目的：观察urantide对缺血再灌注大鼠心肌损伤的影响及其机制，并运用PKC-TK-MAPK信号通路特异性抑制剂白屈菜红碱（CHE）和PI3K-T信号通路特异性抑制
摘要：心血管疾病是严重危害人类生命健康的常见病和多发病，具有很高的死亡率。缺血性心脏病是其中最常见的疾病之一，体现为心肌急剧的缺血缺氧。近年来随着动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环心脏外科手术和心肺脑复苏术等手段的建立和推广运用，能够使缺血的心脏很快恢复血液供应，但同时也发现在心肌缺血基础上恢复血流后，组织损伤加重、甚至发生不可逆性损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤。由此，开发预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的有效药物是国内外医药界关注的热点。Urotensin Ⅱ（U Ⅱ）是一种生长激素样神经环肽，最初以硬骨鱼脊髓尾部分离出来，后来发现在哺乳动物包括人类都普遍有着UⅡ，其广泛分布于脊髓、脑组织和心血管组织。1999年发现U Ⅱ的特异性受体－－UT受体。已证实人类UⅡ（human UⅡ）是迄今已知最强的血管收缩剂，作用强度较ET-1高出1~2个数量级。临床多项探讨也显示，在多种心血管疾病中伴有hUⅡ水平的升高，提示hUⅡ及其受体在心血管疾病中可能有着举足轻重的作用。Urantide是在hUⅡ基础上衍生的肽类UT受体拮抗剂。本课题组前期探讨初步表明，urantide对心肌缺血及缺血再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与减轻细胞膜脂质过氧化、增加NO生成、减轻钙超载等有关。本探讨将分别以整体水平、细胞水平探讨urantide对缺血再灌注大鼠心脏、缺氧再给氧大鼠心肌细胞的保护作用及其机制，重点利用RNA干扰技术下调UT受体表达，在心肌细胞缺氧再给氧模型基础上，探讨urantide对缺氧再给氧心肌细胞保护作用与UT受体之间的联系。第一部分Urantide对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及相关机制探讨目的：观察urantide对缺血再灌注大鼠心肌损伤的影响及其机制，并运用PKC-TK-MAPK信号通路特异性抑制剂白屈菜红碱（CHE）和PI3K-T信号通路特异性抑制剂LY294002，重点探讨urantide对缺血再灌注大鼠心肌细胞保护作用与上面陈述的两条信号通路的作用机制。策略：1.采取大鼠冠状动脉左前降支结扎和松开法（LAD法）制作大鼠缺血再灌注模型，记录心肌缺血/再灌注历程中各组心电图，比较ST段变化情况；在实验结束后，收集各组大鼠血清待测生化指标。2.实验共分8组，分别是：（1）假手术组；（2）模型组；（3）Urantide3μg·kg~(-1)组；（4）Urantide10μg·kg~(-1)组；（5）Urantide30μg·kg~(-1)组；（6）Verapamil（Ver）1.6mg·kg~(-1)组；（3~6组分别于缺血前10min舌下静脉1min内一次性推注相应药物）；（7）Urantide30μg·kg~(-1)+CHE（Chelerythrine，PKC特异性阻断剂）组：在穿线稳定后，舌下静脉快速推注CHE1mg·kg~(-1)，5min后舌下静脉快速推注urantide30μg·kg~(-1)，稳定10min后再行缺血再灌注操作；（8）Urantide30μg·kg~(-1)+LY294002（PI3K-T信号通路阻断剂）组：在穿线稳定后，舌下静脉快速推注LY2940020.3mg·kg~(-1)，5min后舌下静脉快速推注urantide30μg·kg~(-1)，稳定10min后再行缺血再灌注操作；3.检测血清中NO、MDA、cTnI含量和NOS、SOD、LDH、CK的活性；4.实验结束后取心脏行伊文思兰和TTC双染色，计算IS/AAR，即梗死面积。5.实验结束后取心脏常规固定，采取HE染色法观察心肌组织病理结构转变，采取透射电镜观察心肌组织超微结构的转变。6.采取TUNEL法检测心肌细胞中凋亡指数；7.采取免疫组织化学策略检测缺血再灌注后心肌组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的水平并进行半定量浅析；8.采取免疫印迹策略检测缺血再灌注后心肌组织中Akt和p-Akt蛋白表达的水平并进行半定量浅析。结果：1.在大鼠冠状动脉左前降支结扎和松开致心肌缺血再灌注损伤的模型上，urantide（10，30μg·kg~(-1)）对心电图中ST段及T波的抬高有显著的抑制作用；urantide（10，30μg·kg~(-1)）能显著降低梗死区与缺血危险区的比值，而CHE与LY294002能取消urantide的这种保护作用。2. Urantide10，30μg·kg~(-1)两个剂量组可显著降低缺血再灌注大鼠血清中CK、LDH活性，同时可显著降低大鼠血清中升高的cTnI水平。Urantide+CHE与Urantide+LY294002组显示CK、LDH活性及cTnI水平升高，与urantide30μg·kg~(-1)比较有显著性差别。提示urantide对缺血再灌注大鼠心肌细胞的保护作用可被CHE及LY294002取消。3.HE染色光镜下观察和电镜观察结果表明10，30μg·kg~(-1)urantide与模型组相比可显著减轻缺血再灌注诱导的心肌细胞和亚细胞损伤，而Urantide+CHE与Urantide+LY294002组心肌细胞损伤加重，超微结构破坏显著。4. Urantide10，30μg·kg~(-1)两个剂量组可显著降低缺血再灌注大鼠血清中MDA水平，提升NO含量，升高SOD、NOS活性。Urantide+CHE与Urantide+LY294002组MDA水平升高，NO含量、SOD及NOS活性下降，与模型组相比无统计学作用。提示这两种抑制剂可取消urantide对缺血再灌注大鼠心肌细胞的抗氧化作用。5.TUNEL法检测心肌细胞凋亡结果表明，urantide三个剂量组均可以不同程度的降低缺血再灌注大鼠的心肌细胞凋亡指数，而Urantide+CHE组与Urantide+LY294002组心肌细胞凋亡指数与urantide用药组相比显著升高，与模型组相比无统计学作用。6.免疫组化结果显示，urantide可不同程度增加了心肌组织中bcl-2蛋白的表达水平，降低了心肌组织中bax蛋白的表达论文导读：72.1.1urantide对缺血再灌注大鼠心电图ST段的影响402.1.2urantide对缺血再灌注大鼠血清中CK及LDH活性的影响40-412.1.3urantide对缺血再灌注大鼠血清中cTnI含量的影响41-422.1.4urantide对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响42-432.1.5urantide对缺血再灌注大鼠心肌病理组织学的影响43-472.1.6urantide对缺血再灌注大鼠
水平，Urantide+CHE组与Urantide+LY294002组bcl-2及bax蛋白的表达水平与模型组相比无统计学作用。7.Western blot结果显示，urantide各剂量组可不同程度的升高p-Akt/Akt蛋白的比值，Urantide+CHE组与Urantide+LY294002组可降低p-Akt/Akt蛋白的比值。第二部分UT受体下调对urantide抗大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤作用的影响目的：利用RNA干扰技术，将UTsiRNA转染至原代培养心肌细胞，下调UT受体的表达，在乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧模型基础上，观察urantide对心肌细胞缺氧复氧的保护作用与UT受体的联系。策略：1.进行乳鼠心肌细胞原代培养，观察不同培养时间心肌细胞的形态及活力，采取免疫组织化学策略进行心肌细胞鉴定；2.将三种设计合成的UT siRNA用脂质体转染的策略导入原代培养的心肌细胞中，分别用实时定量PCR的策略和Western blot策略检测UT mRNA表达水平和UT蛋白表达水平，筛选出抑制性能最佳的UT siRNA。3.将UT siRNA转染至原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞中，再进行缺氧3h再给氧3h处理，处理前给予urantide10-6mol·L~(-1)，实验结束时收集细胞培养上清，进行相应指标的测定。4.用台盼蓝染色法和MTT染色法分别检测心肌细胞存活率，PI单染色法流式细胞仪检测心肌细胞凋亡，荧光素染料Hoechst33258测定心肌细胞凋亡，检测心肌细胞培养上清中NO、MDA、cTnI含量和NOS、SOD、LDH、CK的活性。结果：1.原代新生大鼠心肌细胞贴壁性能良好，在培养d3细胞搏动显著，搏动频率逐渐加速，至d7天搏动频率开始减少，细胞数量在d3~d4天增加显著；免疫组化策略对心肌细胞进行鉴定，显示心肌细胞纯度可达95%以上。2.实时荧光定量PCR结果和Western blot结果显示三对UT siRNA对UT mRNA表达水平和UT蛋白表达水平均有抑制作用，其中UT siRNA3组与对照组相比有显著性差别，故后续实验中采取UT siRNA3转染心肌细胞下调UT受体表达。3.台盼蓝染色法和MTT染色法均显示urantide10-6mol·L~(-1)能够显著增加细胞存活率，但UTsiRNA转染造成UT受体下调对1×10-6mol·L~(-1)urantide的心肌细胞存活率提升有显著的下降作用，MTT染色法显示心肌细胞存活率以其在正常心肌细胞上的81.13±12.46%降至60.89±9.41%。4.10-6mol·L~(-1)urantide可显著降低细胞培养上清中cTnI含量以及CK、 LDH活性，而在UT受体下调的心肌细胞上，urantide10-6mol·L~(-1)对cTnI含量以及CK、LDH活性的降低作用有显著减弱，cTnI含量以及CK、LDH活性分别以其在正常心肌细胞上的63.73±11.36ng·L~(-1),0.83±0.10U·L~(-1)和109.62±12.66U·L~(-1)分别升高至90.22±12.43ng·L~(-1),1.49±0.08U·L~(-1)和168.90±16.18U·L~(-1)。5.10-6mol·L~(-1)urantide可降低细胞培养上清中MDA含量，同时提升培养上清中SOD和NOS活性及NO含量，在UTsiRNA介导的UT受体下调的心肌细胞上，10-6mol·L~(-1)urantide对MDA含量降低和SOD活性提升作用均有显著减弱，但对其NOS和NO作用未见显著影响。6.采取PI单染法流式细胞仪和Hoechst33258荧光染色分别检测了心肌细胞凋亡，而在UTsiRNA3转染使UT受体下调的心肌细胞上，urantide10-6mol·L~(-1)对缺氧再给氧诱导的心肌细胞凋亡抑制作用有显著减弱，凋亡率以其在正常心肌细胞的8.04±0.85%和6.33±1.23%分别升高至13.90±1.11%和9.96±1.41%。结论：1.Urantide对大鼠缺血再灌注损伤的心肌组织具有显著的保护作用，该作用可能与抗脂质过氧化、增加NO生成、抑制心肌细胞凋亡等有关；2.Urantide抗缺血再灌注心肌细胞损伤作用可能与激活PKC-TK-MAPK信号通路及PI3K-T信号通路有关；3.UT受体介入了urantide对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用；4.UT受体介导了urantide的保护作用的抗脂质过氧化和抗凋亡机制，但没有涉及其对NO生成和释放作用。关键词：Urantide论文心肌细胞论文缺血再灌注论文凋亡论文PKC论文PI3K-T论文RNA干扰论文UT受体论文缺氧复氧论文
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摘要8-14
Abstract14-21
前言21-24
第一部分 urantide 对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及相关机制探讨24-65
1 材料与策略24-40

1.1 实验材料24-27

1.2 实验策略27-39

1.3 统计学处理39-40

2 结果40-56

2.1 urantide对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用40-47

2.

1.1 urantide对缺血再灌注大鼠心电图ST段的影响40

2.

1.2 urantide对缺血再灌注大鼠血清中CK及LDH活性的影响40-41

2.

1.3 urantide对缺血再灌注大鼠血清中cTnI含量的影响41-42

2.

1.4 urantide对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响42-43

2.

1.5 urantide对缺血再灌注大鼠心肌病理组织学的影响43-47

2.

1.6 urantide对缺血再灌注大鼠心肌细胞超微结构损伤程度的影响47

2.2 urantide对大鼠心肌缺血再灌注损论文导读：
伤的保护作用机制47-56
2.2.1 urantide对缺血再灌注大鼠血清中SOD活力、MDA含量的影响47-48

2.2 urantide对缺血再灌注大鼠血清中NO含量、NOS活力的影响48-49

2.2.3 TUNEL法检测urantide对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响49-52
2.2.4 urantide对缺血再灌注大鼠心肌组织中bcl-2和bax表达水平的影响52-55
2.2.5 urantide对缺血再灌注大鼠心肌组织中T和p-T蛋白表达的影响55-56
3 讨论56-65
第二部分 UT 受体下调对 urantide 抗大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤作用的影响65-89
1 材料与策略65-75

1.1 实验材料65-67

1.2 实验策略67-74

1.3 统计学处理74-75

2 结果75-86

2.1 乳鼠心肌细胞鉴定75

2.2 乳鼠心肌细胞形态学观察75-76

2.3 RNA干扰对乳鼠心肌细胞UTmRNA的影响76-78

2.4 RNA干扰对乳鼠心肌细胞UT蛋白表达的影响78-79

2.5 UT受体下调对urantide抗心肌细胞缺氧再给氧损伤的影响79-86

2.5.1 对台盼蓝拒染率的影响79

2.5.2 对细胞存活率的影响79-80

2.5.3 对心肌细胞培养上清中CK、LDH活性的影响80-81

2.5.4 对心肌细胞培养上清中肌钙蛋白含量的影响81

2.5.5 对心肌细胞培养上清中SOD活性、MDA含量的影响81-82

2.5.6 对心肌细胞培养上清中NO含量、NOS活性的影响82-83

2.5.7 对心肌细胞凋亡的影响（流式细胞仪检测）83-84

2.5.8 对心肌细胞Hoechst33258染色的影响84-86

3 讨论86-89
结论89-91
参考文献91-99
附录99-101
致谢101-103
综述103-120
参考文献114-120