论内皮Chemerin与脑梗死和动脉粥样硬化联系及其对HUVEC功能影响初步

论文导读：梗死的发生与进展相关,关于Chemerin与脑梗死和脑梗死患者的动脉粥样硬化病变联系的探讨目前国内外均无相关报道。内皮细胞损伤及随后的持续性炎症反应被认为是动脉粥样硬化的始动因素,多种脂肪细胞因子被证实可直接影响或协同推动血管内皮的功能紊乱诱发动脉粥样硬化进程。Chemerin是机体重要的免疫因子,在多种自身免疫疾病及
摘要：背景：脑卒中是严重危害我国国民生命与健康的主要疾病,已成为我国国民的首位死因。脑梗死占全部脑卒中的50-70%,以动脉粥样硬化病变为病理基础的脑梗死是最常见的类型。由此,深入探讨动脉粥样硬化的发病机制是脑梗死防治的一项重大课题。脂肪组织不仅是储存能量的器官,同时还以旁、自分泌和远距离分泌方式分泌生物活性因子—脂肪细胞因子。多种脂肪细胞因子如瘦素、脂联素和肿瘤坏死因子等能通过影响机体的脂质代谢,胰岛素抵抗,炎症反应等参与代谢综合征、动脉粥样硬化及相关疾病的发生与进展,脂肪细胞因子的探讨已成为动脉粥样硬化性疾病的探讨热点。Chemerin是一种新发现的脂肪细胞因子,其功能受体为G蛋白受体家族成员Chemerin样受体(CMKLR1/ChemR23), Chemerin通过作用于表达ChemR23的细胞参与机体的免疫反应及能量代谢等活动。目前探讨表明,在肥胖、糖尿病及冠心病患者体内Chemerin水平有显著升高；冠状动脉的斑块上其表达丰富,提示Chemerin可能和动脉粥样硬化病变进展有关。我们推测Chemerin与颈动脉粥样硬化病变及脑梗死的发生与进展相关,关于Chemerin与脑梗死和脑梗死患者的动脉粥样硬化病变联系的探讨目前国内外均无相关报道。内皮细胞损伤及随后的持续性炎症反应被认为是动脉粥样硬化的始动因素,多种脂肪细胞因子被证实可直接影响或协同推动血管内皮的功能紊乱诱发动脉粥样硬化进程。Chemerin是机体重要的免疫因子,在多种自身免疫疾病及炎性疾病的早期阶段介导固有免疫及适应免疫,招募未成熟免疫细胞,推动免疫细胞成熟等方面广泛参与机体的免疫反应。目前探讨提示Chemerin可能在动脉粥样硬化病变中具有重要作用,但Chemerin对血管内皮细胞功能是否具有影响这一关键环节尚无探讨。本探讨是国内外首次对Chemerin与脑梗死和脑梗死患者的动脉粥样硬化病变联系探讨,以期为脑梗死及动脉粥样硬化的探讨提供新的靶点,并且在国内外首次于细胞水平上探讨Chemerin对基础情况下及炎性损伤情况下的血管内皮细胞的影响,以而开拓方向,为下一步的探讨提供依据。第一部分血浆Chemerin水平与脑梗死及颈动脉粥样硬化联系的探讨目的：检测脑梗死患者血浆Chemerin水平,探讨其与脑梗死及颈动脉粥样硬化的联系,浅析Chemerin与代谢指标及炎性指标的相关性,为阐明Chemerin对脑梗死和动脉粥样硬化的影响提供依据。策略：选择148例脑梗死急性期患者为病例组和57例健康对照组,采取酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆Chemerin水平,浅析与脑梗死的联系,通过相关性浅析,探讨Chemerin与代谢及炎性指标之间的联系。脑梗死组采取多普勒超声检测颈动脉,计算双侧颈总动脉平均内-中膜厚度(IMT)并依据颈动脉是否有着斑块及其性质分亚组(无斑块组46例,稳定斑块组39例和不稳定斑块组63例),通过Logistic回归浅析Chemerin水平与脑梗死及斑块性质之间的联系。结果：(1)与正常对照组比较,脑梗死患者血浆Chemerin水平显著增高(P0.01), Logistic回归浅析在考虑了高血压史、糖尿病史、冠心病史、高脂血症、吸烟史、血浆超敏C反应蛋白(hsCRP)水平后,Chemerin水平增高并不能使脑梗死的发病风险增加。(OR:1.183;95%CI:0.743-1.885; P=0.479)(2)血浆Chemerin水平与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),收缩压及炎性因子hsCRP和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平正相关(P0.05),与体重指数,空腹血糖,总甘油三酯,胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇,舒张压水平无关；(3)脑梗死患者的血浆Chemerin水平与颈总动脉平均IMT呈正相关(r=0.187；P=0.023)；(4)脑梗死患者中不稳定斑块组的Chemerin水平高于稳定斑块组及无斑块组患者,而稳定斑块组与无斑块组之间无显著差别,经Logistic回归浅析在考虑了hsCRP、低密度脂蛋白胆固醇水平后,Chemerin水平并不能使不稳定斑块的风险增加(OR：1.018；95%CI：0.920-1.127：P=0.729)。结论：(1)脑梗死患者和颈动脉具有不稳定斑块的脑梗死患者拥有较高的血浆Chemerin水平；(2)脑梗死患者的血浆Chemerin水平与代谢指标和炎性指标相关；(3)脑梗死患者的血浆Chemerin水平可能可以预测动脉粥样硬化的严重程度。第二部分Chemerin对HUVEC功能影响的初步探讨目的：通过测定与浅析多种内皮细胞分泌因子的水平,包括：细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1),一氧化氮(nitric oxide,NO),炎性因子白介素-6(Interleukin-6, IL-6)探讨不同浓度Chemerin干预对基础水平的人脐静脉内皮细胞功能的影响及生理浓度的Chemerin对肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)诱导的血管内皮细胞损伤模型的影响。通过检测并浅析细胞内存活关键通路磷脂酰肌醇3激酶途径(Phosphatidypnositol3-kinase/Akt,P13K/Akt)中T,磷酸化T (p-T),内皮型一氧化氮合酶(Endothepal nitric oxide synthase,eNOS)及磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)表达水平,探讨Chemerin的可能作用机制。策略：(1)培养人脐静脉内皮细胞-12细胞株(Human Umbipcal Vein Endothepal Cells-12, HUVEC-12),依据不同浓度的重组Chemerin分别干预24小时或48小时,共12组,Chemerin浓度(0,5,25,50,10论文导读：-12细胞培养上清液中的NO水平,并且在5ng/ml24小时即显著增高,其诱导作用在(0-100ng/ml)范围内呈浓度依赖(P0.05),在25-200ng/ml浓度范围48小时组较24小时组增高无统计学作用(P0.05),而5ng/ml组48小时组较24小时组NO的水平增高(P0.05),各组IL-6、ICAM-1、VCAM-1之间相比无差别(P0.05)；(2)Chemerin组较空白对照组,NO的水平显著
0,200ng/ml)分别为24小时①-⑥组,48小时⑦-12组,运用Griess法测定细胞培养液上清液中NO水平；ELISA试剂盒检测细胞内IL-6、 ICAM-1、VCAM-1水平。通过单因素方差浅析及多重比较,得出Chemerin对基础水平的血管内皮细胞的影响,并结合既往资料与实验结果推算最适干预浓度与时间(浓度：Chemerin100ng/ml,干预时间：24小时)；(2) Chemerin对TNF-a诱导的HUVEC-12细胞损伤模型的影响：设A为未加药物的空白对照组；B为Chemerin组：给予终浓度为(100ng/ml) Chemerin干预；C为TNF-a组给予终浓度为(50ng/ml)TNF-a干预；D为Chemerin+TNF-a组给予终浓度分别为100ng/mlChemerin+50ng/mlTNF-a干预；E为LY294002组,LY294002为P13K特异性抑制剂,给予终浓度分别为100ng/mlChemerin+50ng/ml TNF-a+20μmol/LLY294002干预。于24小时运用上面陈述的策略检测细胞培养上清液中NO水平；HUVEC的IL-6、ICAM-1、VCAM-1水平,运用Real-time PCR检测各组HUVEC-12的TmRNA表达水平,Western Blot法测定T,p-T,eNOS,p-eNOS蛋白水平。通过统计学软件计算浅析结果,以P0.05为有统计学作用。结果：(1) Chemerin能上调HUVCE-12细胞培养上清液中的NO水平,并且在5ng/ml24小时即显著增高,其诱导作用在(0-100ng/ml)范围内呈浓度依赖(P0.05),在25-200ng/ml浓度范围48小时组较24小时组增高无统计学作用(P0.05),而5ng/ml组48小时组较24小时组NO的水平增高(P0.05),各组IL-6、ICAM-1、VCAM-1之间相比无差别(P0.05)；(2) Chemerin组较空白对照组,NO的水平显著上升(P0.01),p-T、eNOS及p-eNOS的水平增加(P0.01),对T蛋白及T mRNA的表达无影响(P0.05)；(3) Chemerin+TNF-a组较TNF-a组IL-6、ICAM-1、VCAM-1、NO的水平均显著下降(P0.01),p-T、eNOS及p-eNOS的水平增加(P0.01),对T蛋白水平及TmRNA表达无影响(P0.05)(4)LY294002组较Chemerin+TNF-a组ICAM-1, VCAM-1, NO增高(P0.05),IL-6未见显著转变(P0.05),下调p-T (P=0.000), p-eNOS及eNOS蛋白表达(P0.05),但对T蛋白水平及TmRNA表达无影响(P0.05)结论：(1) Chemerin能抑制炎性损伤的血管内皮细胞分泌粘附分子和炎性分子,可能对损伤的内皮细胞具有保护作用；(2) Chemerin可以上调NO的释放,以上作用与eNOS及p-eNOS活化有关,P13K/T-eNOS途径参与了上面陈述的作用；(3) Chemerin对炎性损伤下的内皮细胞具有保护潜能,可成为动脉粥样硬化探讨的靶点。关键词：Chemerin论文脑梗死论文动脉粥样硬化论文血管内皮细胞功能论文
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ABSTRACT11-20
縮略词20-21
引言21-24
第一部分 CHEMERIN与脑梗死及颈动脉粥样硬化程度、斑块之间的联系24-49
前言24-26
材料与策略26-33

1、临床资料26-27

2、仪器与试剂27

3、实验策略27-32

4、统计学浅析32-33

结果与浅析33-40

1、探讨对象一般临床资料及实验室资料比较33

2、血浆Chemerin水平与脑梗死的联系33-34

3、血浆Chemerin水平与临床资料及实验室指标的联系34-35

4、Chemerin与IMT的相关性浅析35-36

5、不同性质颈动脉粥样硬化斑块组与血浆Chemerin水平比较36-37

6、不稳定斑块组与非不稳定斑块组资料比较37-38

7、血浆Chemerin水平与不稳定斑块的联系38-40

讨论40-48
结论48-49
第二部分 CHEMERIN对HUVEC-12的影响及相关机制浅析49-93
前言49-52
材料与策略52-68

1、材料52-56

2、实验策略及步骤56-68

结果及浅析68-86

1、人脐静脉内皮细胞培养及鉴定68

2、不同浓度Chemerin干预后内皮细胞ICAM-

1、VCAM-IL-6的水平68-71

3、不同浓度Chemerin干预后对一氧化氮水平的影响71-72

4、Chemerin对TNF-α诱导下HUVEC的影响72-86

讨论86-92
结论92-93
小结93-94
参考文献94-105
综述105-121
参考文献115-121
致谢121-123
博士期间发表论文123