试论生长因子microRNA-133a在心肌梗死大鼠心肌纤维化中作用及机制
最后更新时间：2024-03-30
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论文导读：
摘要：目的microRNA(miRNA)是一类生物体自身产生的非编码蛋白质的小分子RNA,通过调控基因转录和/或翻译水平的表达,广泛参与生命进程及疾病发生进展。探讨发现miRNA与心肌纤维化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理联系密切。心肌梗死是严重危害人类健康的心血管疾病,心梗后出现的心肌纤维化能影响心脏功能甚至诱发猝死等不良预后。本实验观察miR-133a及转化生长因子β1(tranorming growth factor-β1, TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在心梗大鼠不同时间点的表达变化；通过9型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus9, rA9)上调心梗后miR-133a表达,观察miR-133a过表达对TGF-β1、CTGF转录和翻译水平的影响及对心肌纤维化的调控作用,探讨miR-133a在心肌梗死后心肌纤维化中的作用及机制。策略：1.通过冠状动脉前降支缝扎法,建立心肌梗死大鼠模型,随机分为1周、2周、4周组,另设假手术组(Sham组)。采取心脏超声检测心功能相关指标,Masson染色观察心肌胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)、免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达；并用实时荧光定量PCR法(realtime-qPCR)检测心肌miR-133a及TGF-β1、CTGF mRNA表达转变,蛋白印迹法(western blot)检测TGF-β1及CTGF蛋白的表达变化。2.构建携带大鼠miR-133a基因及标记基因绿色荧光蛋白ZsGreen的A质粒载体,基因测序,酶切、PCR鉴定。在293细胞中包装病毒载体rA9-ZsGreen-pre-miR-133a,提取纯化后测定滴度。3.通过冠脉灌注法分别转导PBS缓冲液、rA9-ZsGreen和rA9-ZsGreen-pre-miR-133a至大鼠心脏,再行冠状动脉前降支缝扎手术,分别设为PBS组、ZsGreen组和miR-133a组。同时另设Sham组。荧光显微镜观察绿色荧光表达分布情况。4周后,采取心脏超声检测心功能相关指标,Masson染色观察CVF、免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达；并用realtime-qPCR检测心肌miR-133a及TGF-β1、 CTGF mRNA表达转变,western blot检测TGF-β1及CTGF蛋白的表达变化。结果：1.与Sham组比较,心梗4周组大鼠心功能显著降低(P0.05)。心肌CVF及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平在心梗后随着时间进展逐渐增高。Ⅰ/Ⅲ型胶原比值在心梗1周时无显著升高(P0.05),2周后出现显著升高(P0.01),并在4周进一步升高(P0.01)。2.与Sham组比较,心肌miR-133a表达水平在心梗1周时显著降低(P0.01),表达水平为Sham组的9±4%。之后随着时间进展miR-133a表达逐渐回升,但仍显著低于Sham组(P0.01)。4周组miR-133a表达水平为Sham组的22±6%。3.心肌TGF-β1和CTGF的mRNA及蛋白表达水平均在心梗后出现显著升高(P0.01)。TGF-β1mRNA和蛋白表达水平分别在心梗1周和2周时达高峰后逐渐下降。4周组TGF-β1mRNA和蛋白水平分别为Sham组的4.3倍和2.5倍左右。CTGF mRNA水平在心梗2周时达到高峰后下降,蛋白表达随着时间进展增高。4周组CTGF mRNA和蛋白水平分别为Sham组的3.1倍和1.9倍左右。4.基因测序显示中间载体质粒携带正确的大鼠miR-133a序列,酶切结果显示成功构建了中间载体质粒和rA质粒。纯化提取病毒后,生物滴度测定显示病度为2×107TU/m1。5.荧光显微镜下观察,ZsGreen组及miR-133a组心肌组织有大量绿色荧光广泛均匀分布。导入携带miR-133a的rA9载体后,心肌的miR-133a表达水平较Sham组、PBS组及ZsGreen组显著升高(P0.01)。miR-133a组的miR-133a表达水平是PBS组的6.8倍左右,是Sham组的1.6倍左右。6. miR-133a组心功能较PBS组及ZsGreen组显著改善(P0.05)。miR-133a组的心肌CVF及Ⅰ、Ⅲ胶原表达水平、Ⅰ/Ⅲ型胶原比值较PBS组及ZsGreen组显著降低(P0.01)。7. miR-133a组心肌TGF-β1mRNA表达水平与PBS组及ZsGreen组比较无显著差别(P0.05),CTGF mRNA表达水平较PBS组及ZsGreen组显著降低(P0.01)。miR-133a组心肌TGF-β1及CTGF蛋白表达水平较PBS组及ZsGreen组显著降低(P0.01)。结论：1.心肌miR-133a表达水平在心梗1周时降低,之后稍有回升,4周时仍维持在较低水平。心肌TGF-β1mRNA和蛋白表达水平分别在心梗1周及2周时达高峰,4周时仍有较高表达。心肌CTGF mRNA表达水平在心梗2周时达到高峰,CTGF蛋白表达随时间进展逐步升高。2.rA9能通过冠脉灌注法介导外源基因在心肌组织广泛均匀长期表达,上调心梗后心肌miR-133a表达水平。3.miR-133a过表达能下调心梗后心肌TGF-β1蛋白水平和CTGF mRNA及蛋白水平,以而减少心肌胶原沉积,抑制心肌纤维化,改善心功能。关键词：miR-133a论文心肌梗死论文心肌纤维化论文转化生长因子β1论文结缔组织生长因子论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要4-7
ABSTRACT7-11
目录11-12
前言12-14
第一章 miR-133a与TGF-β1、CTGF在心肌梗死大鼠中的动态变论文导读：60-632策略63-723结果72-824讨论82-855小结85-86参考文献86-95综述95-119参考文献109-119致谢119-120攻读学位期间的探讨成果120上一页12
化14-42
1 材料14-17
2 策略17-26
3 结果26-37
4 讨论37-41
5 小结41-42
第二章 携带miR-133a基因的重组腺相关病毒载体的构建42-60
1 材料42-44
2 策略44-53
3 结果53-57
4 讨论57-59
5 小结59-60
第三章 miR-133a过表达对大鼠心肌纤维化的影响及机制探讨60-86
1 材料60-63
2 策略63-72
3 结果72-82
4 讨论82-85
5 小结85-86
参考文献86-95
综述95-119
参考文献109-119
致谢119-120
攻读学位期间的探讨成果120
摘要：目的microRNA(miRNA)是一类生物体自身产生的非编码蛋白质的小分子RNA,通过调控基因转录和/或翻译水平的表达,广泛参与生命进程及疾病发生进展。探讨发现miRNA与心肌纤维化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理联系密切。心肌梗死是严重危害人类健康的心血管疾病,心梗后出现的心肌纤维化能影响心脏功能甚至诱发猝死等不良预后。本实验观察miR-133a及转化生长因子β1(tranorming growth factor-β1, TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在心梗大鼠不同时间点的表达变化；通过9型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus9, rA9)上调心梗后miR-133a表达,观察miR-133a过表达对TGF-β1、CTGF转录和翻译水平的影响及对心肌纤维化的调控作用,探讨miR-133a在心肌梗死后心肌纤维化中的作用及机制。策略：1.通过冠状动脉前降支缝扎法,建立心肌梗死大鼠模型,随机分为1周、2周、4周组,另设假手术组(Sham组)。采取心脏超声检测心功能相关指标,Masson染色观察心肌胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)、免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达；并用实时荧光定量PCR法(realtime-qPCR)检测心肌miR-133a及TGF-β1、CTGF mRNA表达转变,蛋白印迹法(western blot)检测TGF-β1及CTGF蛋白的表达变化。2.构建携带大鼠miR-133a基因及标记基因绿色荧光蛋白ZsGreen的A质粒载体,基因测序,酶切、PCR鉴定。在293细胞中包装病毒载体rA9-ZsGreen-pre-miR-133a,提取纯化后测定滴度。3.通过冠脉灌注法分别转导PBS缓冲液、rA9-ZsGreen和rA9-ZsGreen-pre-miR-133a至大鼠心脏,再行冠状动脉前降支缝扎手术,分别设为PBS组、ZsGreen组和miR-133a组。同时另设Sham组。荧光显微镜观察绿色荧光表达分布情况。4周后,采取心脏超声检测心功能相关指标,Masson染色观察CVF、免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原表达；并用realtime-qPCR检测心肌miR-133a及TGF-β1、 CTGF mRNA表达转变,western blot检测TGF-β1及CTGF蛋白的表达变化。结果：1.与Sham组比较,心梗4周组大鼠心功能显著降低(P0.05)。心肌CVF及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平在心梗后随着时间进展逐渐增高。Ⅰ/Ⅲ型胶原比值在心梗1周时无显著升高(P0.05),2周后出现显著升高(P0.01),并在4周进一步升高(P0.01)。2.与Sham组比较,心肌miR-133a表达水平在心梗1周时显著降低(P0.01),表达水平为Sham组的9±4%。之后随着时间进展miR-133a表达逐渐回升,但仍显著低于Sham组(P0.01)。4周组miR-133a表达水平为Sham组的22±6%。3.心肌TGF-β1和CTGF的mRNA及蛋白表达水平均在心梗后出现显著升高(P0.01)。TGF-β1mRNA和蛋白表达水平分别在心梗1周和2周时达高峰后逐渐下降。4周组TGF-β1mRNA和蛋白水平分别为Sham组的4.3倍和2.5倍左右。CTGF mRNA水平在心梗2周时达到高峰后下降,蛋白表达随着时间进展增高。4周组CTGF mRNA和蛋白水平分别为Sham组的3.1倍和1.9倍左右。4.基因测序显示中间载体质粒携带正确的大鼠miR-133a序列,酶切结果显示成功构建了中间载体质粒和rA质粒。纯化提取病毒后,生物滴度测定显示病度为2×107TU/m1。5.荧光显微镜下观察,ZsGreen组及miR-133a组心肌组织有大量绿色荧光广泛均匀分布。导入携带miR-133a的rA9载体后,心肌的miR-133a表达水平较Sham组、PBS组及ZsGreen组显著升高(P0.01)。miR-133a组的miR-133a表达水平是PBS组的6.8倍左右,是Sham组的1.6倍左右。6. miR-133a组心功能较PBS组及ZsGreen组显著改善(P0.05)。miR-133a组的心肌CVF及Ⅰ、Ⅲ胶原表达水平、Ⅰ/Ⅲ型胶原比值较PBS组及ZsGreen组显著降低(P0.01)。7. miR-133a组心肌TGF-β1mRNA表达水平与PBS组及ZsGreen组比较无显著差别(P0.05),CTGF mRNA表达水平较PBS组及ZsGreen组显著降低(P0.01)。miR-133a组心肌TGF-β1及CTGF蛋白表达水平较PBS组及ZsGreen组显著降低(P0.01)。结论：1.心肌miR-133a表达水平在心梗1周时降低,之后稍有回升,4周时仍维持在较低水平。心肌TGF-β1mRNA和蛋白表达水平分别在心梗1周及2周时达高峰,4周时仍有较高表达。心肌CTGF mRNA表达水平在心梗2周时达到高峰,CTGF蛋白表达随时间进展逐步升高。2.rA9能通过冠脉灌注法介导外源基因在心肌组织广泛均匀长期表达,上调心梗后心肌miR-133a表达水平。3.miR-133a过表达能下调心梗后心肌TGF-β1蛋白水平和CTGF mRNA及蛋白水平,以而减少心肌胶原沉积,抑制心肌纤维化,改善心功能。关键词：miR-133a论文心肌梗死论文心肌纤维化论文转化生长因子β1论文结缔组织生长因子论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要4-7
ABSTRACT7-11
目录11-12
前言12-14
第一章 miR-133a与TGF-β1、CTGF在心肌梗死大鼠中的动态变论文导读：60-632策略63-723结果72-824讨论82-855小结85-86参考文献86-95综述95-119参考文献109-119致谢119-120攻读学位期间的探讨成果120上一页12
化14-42
1 材料14-17
2 策略17-26
3 结果26-37
4 讨论37-41
5 小结41-42
第二章 携带miR-133a基因的重组腺相关病毒载体的构建42-60
1 材料42-44
2 策略44-53
3 结果53-57
4 讨论57-59
5 小结59-60
第三章 miR-133a过表达对大鼠心肌纤维化的影响及机制探讨60-86
1 材料60-63
2 策略63-72
3 结果72-82
4 讨论82-85
5 小结85-86
参考文献86-95
综述95-119
参考文献109-119
致谢119-120
攻读学位期间的探讨成果120