简析Smurf1HECT类泛素连接酶Smurf1Neddylation修饰

论文导读：饰实验表明在肺癌细胞H1299中Smurf1为KLF2主要的泛素化降解E3。Smurf1靶向降解KLF2后将影响其转录因子活性及其对下游靶基因CD62L和Wee1的调控。除了以Smurf1为线索的主体工作外，我们揭示ATM可以磷酸化修饰微管结合蛋白NuSAP，修饰位点是NuSAPS124位点。ATM磷酸化修饰和结合NuSAP均发生于M期。此外，我们还发现RBBP6可结合转录
摘要：HECT类泛素连接酶（E3）在骨稳态、肿瘤发生、病毒感染等历程中发挥重要功能，但其活性调控机制还很不清楚。Nedd8介导的类泛素修饰称为Neddylation。已知Neddylation修饰是Culpn-Ring类E3激活的必需条件，但其与HECT类E3的联系尚未见报道。本工作发现HECT类泛素连接酶Smurf1和类泛素蛋白Nedd8互作。Smurf1的蛋白稳定性和E3活性受到类泛素蛋白Nedd8的调控，且调控依赖Nedd8的Neddylation修饰能力。Smurf1能够被Nedd8进行Neddylation修饰，尤其在体外修饰系统中，Smurf1可以自我催化发生Neddylation修饰。另外，Smurf1可以与Neddylation修饰反应的E2Ubc12直接相互作用，Smurf1的HECT N-lobe小亚基介导与Ubc12相互作用，Ubc12的N末端1-26氨基酸残基，及中部核心结构域的活性中心H88-D89是结合Smurf1所必须的。Smurf1自我催化Neddylation修饰的酶活中心是26，这个位点突变后Smurf1在体内将不能发生Neddylation修饰。HECT催化结构域中的26突变后直接影响Smurf1对底物，如Smad5、RhoA等的泛素化降解。探讨中还发现Smurf2具有与Smurf1类似的效应与机制。本工作在国际上首次建立HECT类E3与类泛素修饰之间的功能关联，且发现了一类新的HECT类E3活性调控机制。为了鉴定Smurf1更多的底物以拓展它的生物学功能，我们以Smurf1的WW结构域为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选到KLF2为其结合蛋白。KLF2属于Krüppel样家族蛋白成员，主要参与肺的正常发育，T细胞分化、迁移。本工作发现肺癌细胞中的KLF2为Smurf1在细胞核内的靶向降解底物。一系列泛素化修饰实验表明在肺癌细胞H1299中Smurf1为KLF2主要的泛素化降解E3。Smurf1靶向降解KLF2后将影响其转录因子活性及其对下游靶基因CD62L和Wee1的调控。除了以Smurf1为线索的主体工作外，我们揭示ATM可以磷酸化修饰微管结合蛋白NuSAP，修饰位点是NuSAP S124位点。ATM磷酸化修饰和结合NuSAP均发生于M期。此外，我们还发现RBBP6可结合转录抑制因子ZBTB38，并靶向ZBTB38泛素化降解。RBBP6敲低引起的G2/M阻滞和DNA双链断裂损伤可被ZBTB38敲低所阻断。由于RBBP6基因敲除小鼠胚胎致死，我们的探讨将为寻找致死理由提供可浅析的线索。关键词：Neddylation论文Smurf1论文KLF2论文NuSAP论文RBBP6论文
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Abstract5-11
第1章 引言11-20

1.1 Neddylation 修饰系统概述11-15

1.1 Neddylation 修饰的级联酶促反应11-13

1.2 Neddylation 修饰中的 E3 和底物13-15

1.2 HECT 类泛素连接酶 Smurf1 的主要功能及其调控机制15-19

1.2.1 Nedd4 泛素连接酶家族介绍15-16

1.2.2 Smurf1 的主要功能16-18

1.2.3 Smurf1 连接酶的主要调制约18-19

1.3 本论文的探讨目的19-20

第2章 实验材料与策略20-25

2.1 试剂20-21

2.

1.1 免疫印迹相关试剂20

2.

1.2 细胞裂解相关试剂20

2.

1.3 细胞培养相关试剂20-21

2.

1.4 抗体及药品21

2.2 质粒21

2.3 细胞培养21-22

2.4 细胞转染22

2.5 免疫印迹22

2.6 免疫共沉淀22

2.7 报告基因实验22-23

2.8 实时定量 PCR23

2.9 GST pull-down 实验23

2.10 体内修饰实验23

2.11 体外修饰实验23-24

2.12 间接免疫荧光24

2.13 流式细胞术24-25

第3章 泛素连接酶 Smurf1 的 Neddylation 修饰及调控功能25-45

3.1 Nedd8 和 Smurf1 相互作用25-27

3.2 Nedd8 调控 Smurf1 的稳定性和泛素连接酶活性27-29

3.

2.1 Nedd8 对 Smurf1 蛋白水平的调控27

3.

2.2 Nedd8 增强 Smurf1 自我泛素化修饰对其底物的影响27-29

3.3 Nedd8 通过 Neddylation 修饰调控 Smurf1 的稳定性和 E3 活性29-31

3.1 Neddylation 修饰调控 Smurf1 的稳定性29-31

3.2 Neddylation 修饰增强 Smurf1 的 E3 活性31

3.4 Smurf1 能够被 Nedd8 进行 Neddylation 修饰31-35

3.4.1 Smurf1 在细胞内可以被 Neddylation 修饰31-33

3.4.2 Smurf1 在体外能够自我催化 Neddylation 修饰33-35
3.5 Smurf1 是一个新的 HECT 类 Neddylation 修饰 E32535-38

3.5.1 Smurf1 与 Neddylation E2 直接相互作用35-37

3.5.2 Smurf1 有着 Neddylation 修饰酶活中心37-38

3.6 Nedd8 通过 Neddylation 修饰 Smurf2 的稳定性和泛素连接酶活性38-41

3.7 小结41-42

3.8 讨论42-45

第4章 泛素连接酶 Smurf1 推动转录因子 KLF2 的泛素化降解45-53
4.1 在肺癌细胞 H1299 中 Smurf1 推动 KLF2 蛋白的泛素-蛋白酶体降解46-48
4.2 在肺癌细胞 H1299 中 Smurf1 和 KLF2 有论文导读：发生于M期585.4ATM在M期结合NuSAP58-595.5小结59-605.6讨论60-62第6章泛素连接酶RBBP6对BTB家族成员ZBTB38的降解及在细胞周期调控中的功能62-696.1RBBP6与ZBTB38相互作用63-656.2RBBP6泛素化修饰ZBTB385565-676.3讨论67-69第7章结论69-73参考文献73-83致谢83-85附录A实时定量PCR所需引物85-86
着相互作用48

4.3 Smurf1 降解 KLF2 而影响其转录活性48-51

4.4 小结51

4.5 讨论51-53

第5章 ATM磷酸化修饰微管结合蛋白NuSAP参与M期调控53-62

5.1 过表达 NuSAP 造成 G2/M 期阻滞依赖于 ATM 的有着54

5.2 ATM 磷酸化修饰 NuSAP S124 位点造成 G2/M 期阻滞54-58

5.3 ATM 磷酸化修饰 NuSAP 发生于 M 期58

5.4 ATM 在 M 期结合 NuSAP58-59

5.5 小结59-60

5.6 讨论60-62

第6章 泛素连接酶 RBBP6 对 BTB 家族成员 ZBTB38 的降解及在细胞周期调控中的功能62-69

6.1 RBBP6 与 ZBTB38 相互作用63-65

6.2 RBBP6 泛素化修饰 ZBTB385565-67

6.3 讨论67-69

第7章 结论69-73
参考文献73-83
致谢83-85
附录 A 实时定量 PCR 所需引物85-86
附录 B 质粒构建的相关信息86-91
个人简历、在学期间发表的学术论文和探讨成果91