阐述特异性泛素特异性蛋白酶Usp46和Usp26基因错义突变对去泛素化酶活性影响及其流行病学作用生
最后更新时间：2024-02-27
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论文导读：致。本探讨的目的是采取去泛素化酶活性检测体系和meta分析的办法来探讨这些错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响，深入研究Usp26基因错义突变与男性不育症的相关性。第一部分：泛素特异性蛋白酶Usp46基因错义突变对去泛素化酶活性的影响极为在健康人群和ADHD患者中的分布状况目的：去泛素化酶通过负向调节泛素-蛋白酶体通路影响
摘要：泛素-蛋白酶体通路（Ubiquitin proteasome pathway）通过特异性地降解细胞内的蛋白质来调控多种细胞进程，包括细胞周期、免疫反应、肿瘤生长和炎症等。该通路由泛素、泛素化酶（包括泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3）、蛋白酶体和去泛素化酶组成。泛素化酶给底物蛋白加上泛素标签，泛素化的蛋白质被运送到蛋白酶体降解。正如磷酸化和去磷酸化一样，蛋白质的泛素化也是一个可逆的历程，去泛素化酶通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命。尽管在决定蛋白质寿命方面，泛素化与去泛素化同等重要，但对去泛素化酶的探讨远落后于泛素化酶。近年来，去泛素化酶是多种神经精神性疾病的致病基因（包括UCH-L1与帕金森病；USP14与脊髓小脑共济失调等），从及USP7抑癌基因功能的发现，使去泛素化酶的探讨开始引人注目。Usp46和Usp26均属于人类基因组编码的泛素特异性蛋白酶（Ubiquitin-specific protease），是去泛素化酶的亚家族，二者的生理功能至今仍所知甚少。Usp46位于4号染色体长臂双向性情感障碍基因座上（4q12），编码366个氨基酸。2009年Tomida等在Nat Genet上报道了Usp46是调控小鼠“行为绝望”的数量基因，发现Usp46ΔK92突变小鼠在悬尾试验（Tail Suspension Test）和强迫游泳试验（Forced Swimming Test）中几乎没有不动时间。进一步对其机制进行探讨的结果表明，Usp46的第92号赖氨酸的缺失导致了GABA体系异常是主要理由，提示Usp46参与调控GABA体系，然而调控机制不明。本探讨采取去泛素化酶活性检测体系来深入研究第92号赖氨酸的缺失对USP46酶活性的影响，从及人群中Usp46错义突变对酶活性的影响极为与ADHD的关联，为探讨Usp46错义突变与精神性疾病间的关联奠定基础。Usp26定位于Xq26.2，被认为是与男性不育症相关的候选基因，然而各探讨的结果并不一致。本探讨的目的是采取去泛素化酶活性检测体系和meta分析的办法来探讨这些错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响，深入研究Usp26基因错义突变与男性不育症的相关性。第一部分：泛素特异性蛋白酶Usp46基因错义突变对去泛素化酶活性的影响极为在健康人群和ADHD患者中的分布状况目的：去泛素化酶通过负向调节泛素-蛋白酶体通路影响细胞内蛋白质的寿命，参与调节多种细胞进程，其异常与多种疾病相关。2009年Tomida等报道去泛素化酶Usp46是调控小鼠“行为绝望”的数量基因，Usp46第92号赖氨酸缺失（ΔK92）导致了GABA体系异常，是造成突变小鼠在悬尾试验和强迫游泳试验中几乎没有不动时间的主要理由。Usp46引起GABA体系异常的分子机制并不十分清楚。本探讨采取去泛素化酶活性检测体系检测第92号赖氨酸的缺失对USP46酶活性的影响，为探讨Usp46调控GABA体系的分子机制提供新的思路。并且，通过检测人群中Usp46V96I错义突变对酶活性的影响，建立V96I突变的基因分型办法，检测V96I错义突变在健康人群及注意缺陷多动障碍（ADHD）患者中的分布状况，为探讨Usp46错义突变与精神性疾病间的关联奠定基础。办法：1. pGEX-Usp46（ΔK92）及pGEX-Usp46（V96I）突变质粒构建。分别从本室保存的大鼠pGEX-Usp46及人的pGEX-Usp46野生型质粒为模板，使用定点突变的办法构建pGEX-Usp46（ΔK92）及pGEX-Usp46（V96I）突变型。对突变产物进行限制性内切酶酶切和测序鉴定。2. pAC-T7-Usp46（ΔK92）及pAC-T7-Usp46（V96I）突变质粒构建。以构建的pGEX-Usp46各突变质粒酶切出Usp46基因目的片段，连入pAC-T7质粒的BamH I酶切位点中来构建pAC-T7-Usp46（ΔK92）及pGEX-Usp46（V96I）突变质粒，并进行酶切鉴定。3.采取GST‐Ub52模型底物和Ub‐Met‐β‐gal模型底物对Usp46（ΔK92）突变和Usp46（V96I）突变进行去泛素化酶活性分析，Odyssey双色红外激光成像体系扫描。4. Usp46（V96I）突变的基因分型办法的建立及在健康人群和ADHD患者论文导读：明显下降，提示Usp46突变引起的小鼠“行为绝望”表型与酶活性密切相关。2.人类Usp46基因错义突变V96I对酶活性的影响测序结果证实人类Usp46第96号氨基酸成功由缬氨酸突变为异亮氨酸，构建了pGEX-Usp46（V96I）质粒，从及pAC-T7-Usp46（V96I）突变质粒。USP46（V96I）突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36
中的检测。收集健康人群和ADHD患病儿童的血液样本，提取基因组DNA，从Genbank参考序列为基础，设计V96I位点特异性扩增引物，从提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增并测序分型。结果：1.大鼠Usp46第92号赖氨酸缺失对酶活性的影响测序结果证实成功将大鼠92号赖氨酸去除，构建了pGEX-Usp46（ΔK92）质粒，从及pAC-T7-Usp46（ΔK92）突变质粒。USP46（ΔK92）突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36KDa的蛋白产物，相对定量结果显示ΔK92突变使USP46去泛素化酶活性下降为27.04%+7.50%，采取Ub-Met-β-gal模型底物检测的结果与之相似，Usp46ΔK92突变活性下降为42.78%+6.47%，由此采取此两种检测体系均显示USP49的第92号赖氨酸缺失使USP46去泛素化酶活性明显下降，提示Usp46突变引起的小鼠“行为绝望”表型与酶活性密切相关。2.人类Usp46基因错义突变V96I对酶活性的影响测序结果证实人类Usp46第96号氨基酸成功由缬氨酸突变为异亮氨酸，构建了pGEX-Usp46（V96I）质粒，从及pAC-T7-Usp46（V96I）突变质粒。USP46（V96I）突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36KDa的蛋白产物，相对定量结果显示V96I突变使USP46去泛素化酶活性下降为38.51%±1.40%，采取Ub-Met-β-gal模型底物检测的结果一致，USP46（ΔK92）突变活性下降为50.79%±2.60%。由此采取GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物检测活性均显示V96I突变后USP46的去泛素化酶活性明显下降。3.人群中Usp46（V96I）突变的基因分型办法的建立极为在ADHD和健康人群中的检测共收集100例ADHD患病儿童(男性53例，女性47例)，健康人群122份血液标本，提取基因组DNA纯度较好，从V96I位点特异性扩增引物成功扩增出200bp左右的特异DNA条带，测序结果显示ADHD患者和健康人群标本中均不有着V96I突变，此分型办法具有较好的稳定性和可靠性。结论：本探讨采取GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物活性检测体系发现Usp46第92号赖氨酸缺失后，其去泛素化酶活性分别下降了72.96%和57.22%，为探讨抑郁症等精神性疾病的分子机制提供了新的线索。人类Usp46V96I错义突变与ΔK92类似，使USP46去泛素化酶活性明显下降，建立了V96I基因分型的办法，在ADHD患者和健康人群标本中未检测到V96I突变，提示该突变可能不是ADHD的主要致病因素，该办法的建立为进一步开展Usp46错义突变与精神性疾病的关联性探讨奠定了基础。第二部分：370–371ins ACA,494TC,1423CT,1090CT和1737GA错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响目的：Usp26基因同Usp46基因一样，也属于泛素特异性蛋白酶，近来多个探讨发现Usp26基因5个常见的基因突变370–371ins ACA,494TC,1423CT、1090CT和1737GA可能与男性不育症相关，但探讨结果不一致，尤其是基因错义突变是否引起蛋白的功能转变至今尚无报道。本部分为进一步探索此5个错义突变对USP26蛋白功能的影响，构建Usp26突变质粒，采取去泛素化酶活性检测系统检测突变对酶活性的影响，为进一步探索USP26的生理功能极为在不育症中的意义提供线索。办法：1. pGEX‐Usp26突变质粒构建。从本室保存的pGEX‐Usp26为模板，使用定点突变的办法构建5个错义突变，370–371ins ACA,494TC,1423CT、1090CT和1737GA突变型。由于370–371ins ACA,494TC,1423CT常为连锁有着，由此常被统称为cluster单倍体突变。为探讨cluster单倍体突变对活性的影响，在pGEX-Usp26（370–371insACA）突变质粒的基础上再进行494TC和1423CT定点突变，对突变产物进行限制性内切酶酶切和测序鉴定。2. pAC‐T7‐Usp26突变质粒构建。以构建的pGEX‐Usp26论文导读：
各突变质粒BamH I酶切位点切出Usp26基因目的片段，连入pAC-T7质粒的BamH I酶切位点中从构建pAC-T7-Usp26各突变质粒，并进行酶切鉴定。3.采取GST‐Ub52模型底物和Ub‐Met‐β‐gal模型底物对各突变进行去泛素化酶活性分析，Odyssey双色红外激光成像体系扫描。结果：1.突变质粒构建：测序结果证实370–371ins ACA突变引起T123–Q124ins氨基酸转变，494TC突变引起L165S氨基酸转变，1423CT突变引起H475Y氨基酸转变，1090CT突变引起L364F氨基酸转变，1737GA突变引起M579I氨基酸转变，从及cluster单倍体突变引起T123–Q124ins、L165S、H475Y氨基酸转变，构建了pGEX‐Usp26各突变质粒，从及pAC‐T7‐Usp26各突变质粒。2.370–371ins ACA,494TC,1423CT,1090CT和1737GA突变对酶活性的影响：这五种突变与Usp26野生型对模型底物GST‐Ub52的意义相同，均去泛素化GST‐Ub52，产生分子量约36KDa的产物。Ub‐Met‐β‐gal模型底物去泛素化酶活性分析的结果与GST‐Ub52法一致，突变不影响USP26的去泛素化酶活性。3. Cluster单倍体突变对酶活性的影响：USP26（cluster）突变去泛素化GST‐Ub52，产生分子量约36KDa的产物，与野生型USP26的意义一样。Ub‐Met‐β‐gal模型底物去泛素化酶活性分析的结果与GST‐Ub52法一致，说明cluster单倍体突变不影响USP26的去泛素化酶活性。结论：本部分的结果表明Usp26基因370–371ins ACA,494TC,1423CT,1090CT和1737GA及cluster单倍体型错义突变均不影响USP26的去泛素化酶活性，为探索USP26的生理功能极为在不育症中的意义提供了新的线索。第三部分：Usp26基因cluster、1090CT和1737G A错义突变与男性不育症相关性的Meta分析目的：男性不育症是世界性的难题，据统计，全世界育龄夫妇中不孕不育症的发病率约为15%，其中男性不育约占50%。男性不育症病因复杂，除了内分泌、感染、畸形、免疫等理由外，遗传因素越来越受到人们重视，已确定与男性不育症有关的遗传因素包括染色体异常、Y染色体微缺失等基因变化，近年来探讨发现X染色体上的基因变异也可能与男性不育有关，如雄激素受体基因多态性可能导致畸精子症等。近来有多个探讨发现泛素特异性蛋白酶Usp26基因370–371ins ACA,494TC,1423CT、1090CT和1737GA5个常见的基因突变可能与男性不育症相关，然而各探讨的结果不一致。370–371ins ACA,494TC,1423CT常为连锁有着，由此常被统称为cluster突变。在本探讨第二部分发现无论是5个基因突变单个有着还是从cluster单倍体突变，均未影响USP26蛋白的去泛素化酶活性，本探讨部分采取meta分析的办法，综合评价Usp26基因cluster、1090CT和1737GA基因突变与男性不育症的关联强度，为探讨Usp26基因在男性不育症发病中的意义奠定基础。办法：文献检索：从检索词“ubiquitin specific protease26/Usp26”、“maleinfertipty”、“泛素特异性蛋白酶26”和“男性不育”等联合检索PubMed数据库、HuGNet数据库和中文学术期刊全文数据库(ChineseNational Knowledge Infrastructure，CNKI)，检索截止日期2012年9月30日，无语种限制。文献选择：纳入探讨Usp26基因5个常见的基因突变（370–371insACA，494TC，1423CT，1090CT and1737GA）与男性不育症关联性的病例-对照探讨，提取数据。统计分析：釆用Stata11.0软件进行数据分析，运用固定效应模型和随机效应模型估计合并后的OR值(Odds Ratio,OR)和95%可信区间值(95%Confidential Interval，95%CI)来评价关联强度，对合并后的效应值OR进行明显性检验，绘制森林图。异质性检验采取Cochra论文导读：表明cluster基因突变与男性不育症间的关联无统计学作用。依据人种进行的亚组分析，固定效应模型的结果显示高加索人群中合并OR值为1.625，95%CI:0.664-3.977；亚洲人群中的合并OR值为2.252，95%CI:0.865-5.865，提示无论是在高加索人群还是亚洲人群中cluster基因突变与男性不育症的关联无统计学作用。按发表年份进行累积meta分析，
n’s Q test和I2值。采取亚组分析、敏感性分析分析异质性的来源，用漏斗图和Harbord检验评估小规模探讨的效应，检验发表偏倚。结果：符合本探讨纳入标准的文献共9篇，累计男性不育症患者1675例和对照2547例，其中2篇文献的探讨对象是亚洲人群，6篇是高加索人群，1篇既有亚洲人群又有高加索人群。1）Cluster基因突变：有关cluster基因突变与男性不育症相关性的文献共纳入7篇，累计患者1297例和对照2293例。Cochran’ s Q test的结果显示P值为0.29，I2为17.2%，提示可能有着轻度异质性。随机效应模型结果显示，合并OR值为1.55，95%CI:0.82-2.93，表明cluster基因突变与男性不育症间的关联无统计学作用。依据人种进行的亚组分析，固定效应模型的结果显示高加索人群中合并OR值为1.625，95%CI:0.664-3.977；亚洲人群中的合并OR值为2.252，95%CI:0.865-5.865，提示无论是在高加索人群还是亚洲人群中cluster基因突变与男性不育症的关联无统计学作用。按发表年份进行累积meta分析，显示随着年份的增多cluster基因突变与男性不育症的发病呈现出无关联的走势。敏感性分析显示，逐个剔除探讨后关联不受单个探讨的影响，说明了结果的可靠性。漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P0.05，不有着小规模探讨效应，无发表偏倚。无精子症和少精子症与cluster突变关联性探讨的meta分析表明，cluster基因突变与无精子症的关联无统计学作用，随机效应模型显示合并OR值为2.039，95%CI:0.955-4.357。cluster基因突变与少精子症的的关联无统计学作用，随机效应模型显示合并OR值为0.896，95%CI：0.252-3.186。对照组中cluster的突变频率meta分析表明，异质性检验结果为P=0.018（0.10），I2为53.4%，表明探讨间有着高度异质性，不适合计算对照组的合并突变率。依对照人群的特点分为参数正常组、已生育组、生育状况未知组进行亚组分析，随机效应模型的结果显示三个对照组中参数正常组的合并突变率最低为2.15%（95%CI：0.81%-5.61%），而生育状况未知组的合并突变率最高为3.69%（95%CI：0.70%-17.34%)。依据对照不同，将患者分别与参数正常组、已生育组、生育状况未知组三个对照组进行meta分析，随机效应模型结果显示合并OR值（95%CI）分别为1.876(0.812-4.333)，1.481（0.613-3.579）和1.597（0.230-11.097）2）1090CT基因突变：有关1090CT基因突变与男性不育症相关性的文献共纳入4篇，累计患者866例和对照558例。采取随机效应模型合并数据，合并OR值为1.598，95%CI：0.933-2.735，Cochran’ s Q test的结果显示P值为0.49，I2为0，提示不有着统计学上的异质性。表明1090CT基因突变与男性不育症间的关联无统计学作用。累积meta分析显示随着年份的增多cluster基因突变与男性不育症的发病呈现出无关联的走势。敏感性分析显示结果可靠，逐个剔除探讨后关联受单个探讨的影响较小。漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P0.05,不有着小规模探讨效应，无发表偏倚。3）1737GA基因突变有关1737GA基因突变与男性不育症相关性的文献纳入3篇，累计患者688例和对照504例。异质性检验Cochran’ s Q test的结果显示P值为0.229，I2为32.2%，提示可能有着中等程度的异质性。随机效应模型合并OR值为2.641，95%CI：0.969-7.194。累积meta分析和敏感性分析结果显示，Lee等的探讨对探讨结果影响较大。采取漏斗图示意发表偏倚的状况，纳入的文献完整地出现在图上，漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P0.05,说明不有着小规模探讨效应，无偏倚状况。由于此位点纳入文献较少，由此其结论还有待于进一步的探讨证实。结论：Meta分析的结果表明尚不能认为泛素特异性蛋白酶Usp26基因cluster、1090CT和1737GA基因突变与男性不育症的发病相关。论文导读：酶Usp46基因错义突变对去泛素化酶活性的影响极为在健康人群和ADHD患者中的分布状况23-50前言23-25材料与办法25-31结果31-36附图36-45讨论45-47小结47参考文献47-50第二部分370–371insACA,494T>C,1423C>T,1090C>T和1737G>A错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响50-70前言50-51材料与办法51-53结果53-57附图
关键词：泛素特异性蛋白酶论文基因突变论文去泛素化酶活性论文meta-analysis论文男性不育症论文
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摘要5-13
ABSTRACT13-21
引言21-23
第一部分 泛素特异性蛋白酶 Usp46 基因错义突变对去泛素化酶活性的影响极为在健康人群和 ADHD 患者中的分布状况23-50
前言23-25
材料与办法25-31
结果31-36
附图36-45
讨论45-47
小结47
参考文献47-50
第二部分 370–371 insACA, 494 T>C, 1423 C>T, 1090 C>T 和 1737 G>A 错义突变对 USP26 去泛素化酶活性的影响50-70
前言50-51
材料与办法51-53
结果53-57
附图57-65
附表65-66
讨论66-67
小结67
参考文献67-70
第三部分 Usp26 基因 cluster、1090 C>T 和 1737 G>A 错义突变与男性不育症相关性的 Meta分析70-105
前言70-71
材料与办法71-73
结果73-78
附图78-95
附表95-99
讨论99-101
小结101
参考文献101-105
结论105-106
综述106-124
参考文献115-124
致谢124-125
个人简历125
摘要：泛素-蛋白酶体通路（Ubiquitin proteasome pathway）通过特异性地降解细胞内的蛋白质来调控多种细胞进程，包括细胞周期、免疫反应、肿瘤生长和炎症等。该通路由泛素、泛素化酶（包括泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3）、蛋白酶体和去泛素化酶组成。泛素化酶给底物蛋白加上泛素标签，泛素化的蛋白质被运送到蛋白酶体降解。正如磷酸化和去磷酸化一样，蛋白质的泛素化也是一个可逆的历程，去泛素化酶通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命。尽管在决定蛋白质寿命方面，泛素化与去泛素化同等重要，但对去泛素化酶的探讨远落后于泛素化酶。近年来，去泛素化酶是多种神经精神性疾病的致病基因（包括UCH-L1与帕金森病；USP14与脊髓小脑共济失调等），从及USP7抑癌基因功能的发现，使去泛素化酶的探讨开始引人注目。Usp46和Usp26均属于人类基因组编码的泛素特异性蛋白酶（Ubiquitin-specific protease），是去泛素化酶的亚家族，二者的生理功能至今仍所知甚少。Usp46位于4号染色体长臂双向性情感障碍基因座上（4q12），编码366个氨基酸。2009年Tomida等在Nat Genet上报道了Usp46是调控小鼠“行为绝望”的数量基因，发现Usp46ΔK92突变小鼠在悬尾试验（Tail Suspension Test）和强迫游泳试验（Forced Swimming Test）中几乎没有不动时间。进一步对其机制进行探讨的结果表明，Usp46的第92号赖氨酸的缺失导致了GABA体系异常是主要理由，提示Usp46参与调控GABA体系，然而调控机制不明。本探讨采取去泛素化酶活性检测体系来深入研究第92号赖氨酸的缺失对USP46酶活性的影响，从及人群中Usp46错义突变对酶活性的影响极为与ADHD的关联，为探讨Usp46错义突变与精神性疾病间的关联奠定基础。Usp26定位于Xq26.2，被认为是与男性不育症相关的候选基因，然而各探讨的结果并不一致。本探讨的目的是采取去泛素化酶活性检测体系和meta分析的办法来探讨这些错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响，深入研究Usp26基因错义突变与男性不育症的相关性。第一部分：泛素特异性蛋白酶Usp46基因错义突变对去泛素化酶活性的影响极为在健康人群和ADHD患者中的分布状况目的：去泛素化酶通过负向调节泛素-蛋白酶体通路影响细胞内蛋白质的寿命，参与调节多种细胞进程，其异常与多种疾病相关。2009年Tomida等报道去泛素化酶Usp46是调控小鼠“行为绝望”的数量基因，Usp46第92号赖氨酸缺失（ΔK92）导致了GABA体系异常，是造成突变小鼠在悬尾试验和强迫游泳试验中几乎没有不动时间的主要理由。Usp46引起GABA体系异常的分子机制并不十分清楚。本探讨采取去泛素化酶活性检测体系检测第92号赖氨酸的缺失对USP46酶活性的影响，为探讨Usp46调控GABA体系的分子机制提供新的思路。并且，通过检测人群中Usp46V96I错义突变对酶活性的影响，建立V96I突变的基因分型办法，检测V96I错义突变在健康人群及注意缺陷多动障碍（ADHD）患者中的分布状况，为探讨Usp46错义突变与精神性疾病间的关联奠定基础。办法：1. pGEX-Usp46（ΔK92）及pGEX-Usp46（V96I）突变质粒构建。分别从本室保存的大鼠pGEX-Usp46及人的pGEX-Usp46野生型质粒为模板，使用定点突变的办法构建pGEX-Usp46（ΔK92）及pGEX-Usp46（V96I）突变型。对突变产物进行限制性内切酶酶切和测序鉴定。2. pAC-T7-Usp46（ΔK92）及pAC-T7-Usp46（V96I）突变质粒构建。以构建的pGEX-Usp46各突变质粒酶切出Usp46基因目的片段，连入pAC-T7质粒的BamH I酶切位点中来构建pAC-T7-Usp46（ΔK92）及pGEX-Usp46（V96I）突变质粒，并进行酶切鉴定。3.采取GST‐Ub52模型底物和Ub‐Met‐β‐gal模型底物对Usp46（ΔK92）突变和Usp46（V96I）突变进行去泛素化酶活性分析，Odyssey双色红外激光成像体系扫描。4. Usp46（V96I）突变的基因分型办法的建立及在健康人群和ADHD患者论文导读：明显下降，提示Usp46突变引起的小鼠“行为绝望”表型与酶活性密切相关。2.人类Usp46基因错义突变V96I对酶活性的影响测序结果证实人类Usp46第96号氨基酸成功由缬氨酸突变为异亮氨酸，构建了pGEX-Usp46（V96I）质粒，从及pAC-T7-Usp46（V96I）突变质粒。USP46（V96I）突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36
中的检测。收集健康人群和ADHD患病儿童的血液样本，提取基因组DNA，从Genbank参考序列为基础，设计V96I位点特异性扩增引物，从提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增并测序分型。结果：1.大鼠Usp46第92号赖氨酸缺失对酶活性的影响测序结果证实成功将大鼠92号赖氨酸去除，构建了pGEX-Usp46（ΔK92）质粒，从及pAC-T7-Usp46（ΔK92）突变质粒。USP46（ΔK92）突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36KDa的蛋白产物，相对定量结果显示ΔK92突变使USP46去泛素化酶活性下降为27.04%+7.50%，采取Ub-Met-β-gal模型底物检测的结果与之相似，Usp46ΔK92突变活性下降为42.78%+6.47%，由此采取此两种检测体系均显示USP49的第92号赖氨酸缺失使USP46去泛素化酶活性明显下降，提示Usp46突变引起的小鼠“行为绝望”表型与酶活性密切相关。2.人类Usp46基因错义突变V96I对酶活性的影响测序结果证实人类Usp46第96号氨基酸成功由缬氨酸突变为异亮氨酸，构建了pGEX-Usp46（V96I）质粒，从及pAC-T7-Usp46（V96I）突变质粒。USP46（V96I）突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36KDa的蛋白产物，相对定量结果显示V96I突变使USP46去泛素化酶活性下降为38.51%±1.40%，采取Ub-Met-β-gal模型底物检测的结果一致，USP46（ΔK92）突变活性下降为50.79%±2.60%。由此采取GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物检测活性均显示V96I突变后USP46的去泛素化酶活性明显下降。3.人群中Usp46（V96I）突变的基因分型办法的建立极为在ADHD和健康人群中的检测共收集100例ADHD患病儿童(男性53例，女性47例)，健康人群122份血液标本，提取基因组DNA纯度较好，从V96I位点特异性扩增引物成功扩增出200bp左右的特异DNA条带，测序结果显示ADHD患者和健康人群标本中均不有着V96I突变，此分型办法具有较好的稳定性和可靠性。结论：本探讨采取GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物活性检测体系发现Usp46第92号赖氨酸缺失后，其去泛素化酶活性分别下降了72.96%和57.22%，为探讨抑郁症等精神性疾病的分子机制提供了新的线索。人类Usp46V96I错义突变与ΔK92类似，使USP46去泛素化酶活性明显下降，建立了V96I基因分型的办法，在ADHD患者和健康人群标本中未检测到V96I突变，提示该突变可能不是ADHD的主要致病因素，该办法的建立为进一步开展Usp46错义突变与精神性疾病的关联性探讨奠定了基础。第二部分：370–371ins ACA,494TC,1423CT,1090CT和1737GA错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响目的：Usp26基因同Usp46基因一样，也属于泛素特异性蛋白酶，近来多个探讨发现Usp26基因5个常见的基因突变370–371ins ACA,494TC,1423CT、1090CT和1737GA可能与男性不育症相关，但探讨结果不一致，尤其是基因错义突变是否引起蛋白的功能转变至今尚无报道。本部分为进一步探索此5个错义突变对USP26蛋白功能的影响，构建Usp26突变质粒，采取去泛素化酶活性检测系统检测突变对酶活性的影响，为进一步探索USP26的生理功能极为在不育症中的意义提供线索。办法：1. pGEX‐Usp26突变质粒构建。从本室保存的pGEX‐Usp26为模板，使用定点突变的办法构建5个错义突变，370–371ins ACA,494TC,1423CT、1090CT和1737GA突变型。由于370–371ins ACA,494TC,1423CT常为连锁有着，由此常被统称为cluster单倍体突变。为探讨cluster单倍体突变对活性的影响，在pGEX-Usp26（370–371insACA）突变质粒的基础上再进行494TC和1423CT定点突变，对突变产物进行限制性内切酶酶切和测序鉴定。2. pAC‐T7‐Usp26突变质粒构建。以构建的pGEX‐Usp26论文导读：
各突变质粒BamH I酶切位点切出Usp26基因目的片段，连入pAC-T7质粒的BamH I酶切位点中从构建pAC-T7-Usp26各突变质粒，并进行酶切鉴定。3.采取GST‐Ub52模型底物和Ub‐Met‐β‐gal模型底物对各突变进行去泛素化酶活性分析，Odyssey双色红外激光成像体系扫描。结果：1.突变质粒构建：测序结果证实370–371ins ACA突变引起T123–Q124ins氨基酸转变，494TC突变引起L165S氨基酸转变，1423CT突变引起H475Y氨基酸转变，1090CT突变引起L364F氨基酸转变，1737GA突变引起M579I氨基酸转变，从及cluster单倍体突变引起T123–Q124ins、L165S、H475Y氨基酸转变，构建了pGEX‐Usp26各突变质粒，从及pAC‐T7‐Usp26各突变质粒。2.370–371ins ACA,494TC,1423CT,1090CT和1737GA突变对酶活性的影响：这五种突变与Usp26野生型对模型底物GST‐Ub52的意义相同，均去泛素化GST‐Ub52，产生分子量约36KDa的产物。Ub‐Met‐β‐gal模型底物去泛素化酶活性分析的结果与GST‐Ub52法一致，突变不影响USP26的去泛素化酶活性。3. Cluster单倍体突变对酶活性的影响：USP26（cluster）突变去泛素化GST‐Ub52，产生分子量约36KDa的产物，与野生型USP26的意义一样。Ub‐Met‐β‐gal模型底物去泛素化酶活性分析的结果与GST‐Ub52法一致，说明cluster单倍体突变不影响USP26的去泛素化酶活性。结论：本部分的结果表明Usp26基因370–371ins ACA,494TC,1423CT,1090CT和1737GA及cluster单倍体型错义突变均不影响USP26的去泛素化酶活性，为探索USP26的生理功能极为在不育症中的意义提供了新的线索。第三部分：Usp26基因cluster、1090CT和1737G A错义突变与男性不育症相关性的Meta分析目的：男性不育症是世界性的难题，据统计，全世界育龄夫妇中不孕不育症的发病率约为15%，其中男性不育约占50%。男性不育症病因复杂，除了内分泌、感染、畸形、免疫等理由外，遗传因素越来越受到人们重视，已确定与男性不育症有关的遗传因素包括染色体异常、Y染色体微缺失等基因变化，近年来探讨发现X染色体上的基因变异也可能与男性不育有关，如雄激素受体基因多态性可能导致畸精子症等。近来有多个探讨发现泛素特异性蛋白酶Usp26基因370–371ins ACA,494TC,1423CT、1090CT和1737GA5个常见的基因突变可能与男性不育症相关，然而各探讨的结果不一致。370–371ins ACA,494TC,1423CT常为连锁有着，由此常被统称为cluster突变。在本探讨第二部分发现无论是5个基因突变单个有着还是从cluster单倍体突变，均未影响USP26蛋白的去泛素化酶活性，本探讨部分采取meta分析的办法，综合评价Usp26基因cluster、1090CT和1737GA基因突变与男性不育症的关联强度，为探讨Usp26基因在男性不育症发病中的意义奠定基础。办法：文献检索：从检索词“ubiquitin specific protease26/Usp26”、“maleinfertipty”、“泛素特异性蛋白酶26”和“男性不育”等联合检索PubMed数据库、HuGNet数据库和中文学术期刊全文数据库(ChineseNational Knowledge Infrastructure，CNKI)，检索截止日期2012年9月30日，无语种限制。文献选择：纳入探讨Usp26基因5个常见的基因突变（370–371insACA，494TC，1423CT，1090CT and1737GA）与男性不育症关联性的病例-对照探讨，提取数据。统计分析：釆用Stata11.0软件进行数据分析，运用固定效应模型和随机效应模型估计合并后的OR值(Odds Ratio,OR)和95%可信区间值(95%Confidential Interval，95%CI)来评价关联强度，对合并后的效应值OR进行明显性检验，绘制森林图。异质性检验采取Cochra论文导读：表明cluster基因突变与男性不育症间的关联无统计学作用。依据人种进行的亚组分析，固定效应模型的结果显示高加索人群中合并OR值为1.625，95%CI:0.664-3.977；亚洲人群中的合并OR值为2.252，95%CI:0.865-5.865，提示无论是在高加索人群还是亚洲人群中cluster基因突变与男性不育症的关联无统计学作用。按发表年份进行累积meta分析，
n’s Q test和I2值。采取亚组分析、敏感性分析分析异质性的来源，用漏斗图和Harbord检验评估小规模探讨的效应，检验发表偏倚。结果：符合本探讨纳入标准的文献共9篇，累计男性不育症患者1675例和对照2547例，其中2篇文献的探讨对象是亚洲人群，6篇是高加索人群，1篇既有亚洲人群又有高加索人群。1）Cluster基因突变：有关cluster基因突变与男性不育症相关性的文献共纳入7篇，累计患者1297例和对照2293例。Cochran’ s Q test的结果显示P值为0.29，I2为17.2%，提示可能有着轻度异质性。随机效应模型结果显示，合并OR值为1.55，95%CI:0.82-2.93，表明cluster基因突变与男性不育症间的关联无统计学作用。依据人种进行的亚组分析，固定效应模型的结果显示高加索人群中合并OR值为1.625，95%CI:0.664-3.977；亚洲人群中的合并OR值为2.252，95%CI:0.865-5.865，提示无论是在高加索人群还是亚洲人群中cluster基因突变与男性不育症的关联无统计学作用。按发表年份进行累积meta分析，显示随着年份的增多cluster基因突变与男性不育症的发病呈现出无关联的走势。敏感性分析显示，逐个剔除探讨后关联不受单个探讨的影响，说明了结果的可靠性。漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P0.05，不有着小规模探讨效应，无发表偏倚。无精子症和少精子症与cluster突变关联性探讨的meta分析表明，cluster基因突变与无精子症的关联无统计学作用，随机效应模型显示合并OR值为2.039，95%CI:0.955-4.357。cluster基因突变与少精子症的的关联无统计学作用，随机效应模型显示合并OR值为0.896，95%CI：0.252-3.186。对照组中cluster的突变频率meta分析表明，异质性检验结果为P=0.018（0.10），I2为53.4%，表明探讨间有着高度异质性，不适合计算对照组的合并突变率。依对照人群的特点分为参数正常组、已生育组、生育状况未知组进行亚组分析，随机效应模型的结果显示三个对照组中参数正常组的合并突变率最低为2.15%（95%CI：0.81%-5.61%），而生育状况未知组的合并突变率最高为3.69%（95%CI：0.70%-17.34%)。依据对照不同，将患者分别与参数正常组、已生育组、生育状况未知组三个对照组进行meta分析，随机效应模型结果显示合并OR值（95%CI）分别为1.876(0.812-4.333)，1.481（0.613-3.579）和1.597（0.230-11.097）2）1090CT基因突变：有关1090CT基因突变与男性不育症相关性的文献共纳入4篇，累计患者866例和对照558例。采取随机效应模型合并数据，合并OR值为1.598，95%CI：0.933-2.735，Cochran’ s Q test的结果显示P值为0.49，I2为0，提示不有着统计学上的异质性。表明1090CT基因突变与男性不育症间的关联无统计学作用。累积meta分析显示随着年份的增多cluster基因突变与男性不育症的发病呈现出无关联的走势。敏感性分析显示结果可靠，逐个剔除探讨后关联受单个探讨的影响较小。漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P0.05,不有着小规模探讨效应，无发表偏倚。3）1737GA基因突变有关1737GA基因突变与男性不育症相关性的文献纳入3篇，累计患者688例和对照504例。异质性检验Cochran’ s Q test的结果显示P值为0.229，I2为32.2%，提示可能有着中等程度的异质性。随机效应模型合并OR值为2.641，95%CI：0.969-7.194。累积meta分析和敏感性分析结果显示，Lee等的探讨对探讨结果影响较大。采取漏斗图示意发表偏倚的状况，纳入的文献完整地出现在图上，漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P0.05,说明不有着小规模探讨效应，无偏倚状况。由于此位点纳入文献较少，由此其结论还有待于进一步的探讨证实。结论：Meta分析的结果表明尚不能认为泛素特异性蛋白酶Usp26基因cluster、1090CT和1737GA基因突变与男性不育症的发病相关。论文导读：酶Usp46基因错义突变对去泛素化酶活性的影响极为在健康人群和ADHD患者中的分布状况23-50前言23-25材料与办法25-31结果31-36附图36-45讨论45-47小结47参考文献47-50第二部分370–371insACA,494T>C,1423C>T,1090C>T和1737G>A错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响50-70前言50-51材料与办法51-53结果53-57附图
关键词：泛素特异性蛋白酶论文基因突变论文去泛素化酶活性论文meta-analysis论文男性不育症论文
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摘要5-13
ABSTRACT13-21
引言21-23
第一部分 泛素特异性蛋白酶 Usp46 基因错义突变对去泛素化酶活性的影响极为在健康人群和 ADHD 患者中的分布状况23-50
前言23-25
材料与办法25-31
结果31-36
附图36-45
讨论45-47
小结47
参考文献47-50
第二部分 370–371 insACA, 494 T>C, 1423 C>T, 1090 C>T 和 1737 G>A 错义突变对 USP26 去泛素化酶活性的影响50-70
前言50-51
材料与办法51-53
结果53-57
附图57-65
附表65-66
讨论66-67
小结67
参考文献67-70
第三部分 Usp26 基因 cluster、1090 C>T 和 1737 G>A 错义突变与男性不育症相关性的 Meta分析70-105
前言70-71
材料与办法71-73
结果73-78
附图78-95
附表95-99
讨论99-101
小结101
参考文献101-105
结论105-106
综述106-124
参考文献115-124
致谢124-125
个人简历125