简论降解长双歧杆菌NCC2705胆盐水解酶基因（bsh）克隆表达及其特性

论文导读：pDG7-bsh/NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705的特性32-363.3.2长双歧杆菌NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705的发酵牛乳特性36-393.4小结39-41第四章结论与展望41-44

4.1结论412展望41-44参考文献44-47致谢47-48作者介绍48

摘要：双歧杆菌的胆盐水解酶可能与双歧杆菌的胆盐耐受性和降胆固醇能力有关，通过基因工程、发酵工程等手段，构建过量表达胆盐水解酶基因（bsh）的双歧杆菌，有可能作为降胆固醇药品或保健食品而加以运用。长双歧杆菌通常分离自成人和婴儿粪便，它具有适应高浓度胆盐（浓度通常在5mM以下）、利用低聚糖和适于在结肠中生长的特点，是目前可用于保健食品的一种双歧杆菌。本探讨以长双歧杆菌NCC2705为模板，对bsh进行克隆，构建pGEX-4T-1-bsh/BL2（1DE3）、pDG7-bsh/NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705三个菌株，探讨了bsh在大肠杆菌中的诱导表达条件和在双歧杆菌中过量表达后菌株的胆盐耐受性、胆固醇降解能力以及发酵牛乳特性，以期为开发高效降胆固醇的双歧杆菌起指导作用。探讨采取常规原核表达策略，构建了质粒pGEX-4T-1-bsh并转化至大肠杆菌BL21（DE3），bsh在大肠杆菌pGEX-4T-1-bsh/BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，纯化其表达菌液上清，通过纯化GST-bsh融合蛋白和GST空标签的SDS-PAGE凝胶电泳结果浅析，得到的胆盐水解酶的分子量约为35KDa；构建了质粒pMgap-bsh和pDG7-bsh，电击转化双歧杆菌NCC2705，使bsh在NCC2705中过量表达。对NCC2705、pDG7-bsh/NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705进行生长曲线、胆盐耐受性和降胆固醇能力探讨。结果表明这三个菌株的生长曲线差别不大；三个菌株的胆盐耐受性不同，其中pMgap-bsh/NCC2705体现出了比NCC2705和pDG7-bsh/NCC2705较高的胆盐耐受性；三个菌株具有降解胆固醇的能力，并且其途径不是单一的，添加胆盐后，虽然菌体生长显著受到了抑制，但是菌株的胆固醇降解率显著提升了，胆固醇降解率能达到35%以上，并且pMgap-bsh/NCC2705具有比NCC2705和pDG7-bsh/NCC2705较高的降解胆固醇能力。将NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705分别与酸奶发酵剂混合发酵，优化工艺参数为接种量6%，双歧杆菌发酵剂与混合发酵剂的接种比例为1:2，39℃发酵5h。发酵结束后，得到的发酵乳酸度、感官指标和活菌数都能达到商品发酵乳的要求。在4℃冷藏期间，发酵乳酸度均在120oT以下，活菌数均在108cfu/mL以上，并且酸度均随冷藏时间的延长而增大，活菌数均随冷藏时间的延长而降低，其中含pMgap-bsh/NCC2705的发酵乳酸度和活菌数的变化均慢于含NCC2705的发酵乳。关键词：长双歧杆菌NCC2705论文胆盐水解酶基因的克隆表达论文胆盐耐受性论文胆固醇降解率论文发酵特性论文
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ABSTRACT6-10
第一章 文献综述10-18

1.1 双歧杆菌探讨概述10-13

1.1 双歧杆菌的分类10

1.2 双歧杆菌的生物学特点10-11

1.3 双歧杆菌的生理功能11-12

1.4 双歧杆菌的运用12

1.5 双歧杆菌酸奶12-13

1.2 益生菌胆盐水解酶的探讨近况13-18

1.2.1 益生菌的降胆固醇机理13-15

1.2.2 双歧杆菌胆盐水解酶探讨15-16

1.2.3 胆盐水解酶的生理作用16-18

第二章 胆盐水解酶基因的克隆表达18-28

2.1 材料和仪器19-20

2.

1.1 菌株及质粒19-20

2.

1.2 主要材料与试剂20

2.

1.3 主要仪器设备20

2.2 试验策略20-25

2.1 细菌培养20

2.2 试剂配制20-21

2.3 bsh 的克隆21-22

2.4 重组质粒的构建22-23

2.5 重组子的筛选与鉴定23-24

2.6 bsh 的诱导表达24

2.7 表达蛋白的提取与纯化24-25

2.3 结果与浅析25-27

2.3.1 bsh 的克隆25

2.3.2 重组子的筛选与鉴定25-27

2.4 小结27-28

第三章 菌株特性探讨28-41

3.1 材料和仪器28-29

3.

1.1 菌株及质粒28

3.

1.2 主要试剂、材料28

3.

1.3 主要仪器设备28-29

3.2 试验策略29-32
3.

2.1 细菌培养29

3.

2.2 试剂配制29-30

3.2.3 NCC2705、pDG7-bsh/NCC2705 和 pMgap-bsh/NCC2705 的特性探讨30-31
3.2.4 长双歧杆菌 NCC2705 和 pMgap-bsh/NCC2705 发酵牛乳特性31-32

3.3 试验结果32-39

3.3.1 NCC2705、pDG7-bsh/NCC2705 和 pMgap-bsh/NCC2705 的特性32-36
3.3.2 长双歧杆菌 NCC2705 和 pMgap-bsh/NCC2705 的发酵牛乳特性36-39

3.4 小结39-41

第四章 结论与展望41-44

4.1 结论41

4.2 展望41-44

参考文献44-47
致谢47-48
作者介绍48