谈述杆菌双歧杆菌脂磷壁酸激活巨噬细胞产生TNF—α信号通路

论文导读：
[摘要] 目的 探讨双歧杆菌的脂磷壁酸对巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α（TNF-α）的激活作用。方法 将7～10周龄的Bal/c小鼠20只随机均分成脂磷壁酸组和对照组，脂磷壁酸组小鼠给予注射脂磷壁酸溶液3 ml，每天1次，连续10 d；对照组小鼠给予注射缓冲溶液3 ml，每天1次，连续10 d。观察两组小鼠TNF-α活性。结果 脂磷壁酸组小鼠的TNF-α为（78.45±34.21）U/ml，对照组小鼠的TNF-α为（34.54±13.45）U/ml，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 双歧杆菌的脂磷壁酸能激活巨噬细胞产生TNF-α，从而为临床治疗提供依据。
[关键词] 脂磷壁酸；巨噬细胞；肿瘤坏死因子α
[] A [文章编号] 1674-4721（2013）07（c）-0102-02
黏附于动物肠道内最主要的细菌就是双歧杆菌。双歧杆菌是机体内的正常细菌，它们的存在对维持机体肠道内菌种生态平衡有重要的促进作用。脂磷壁酸是革兰阳性菌细胞壁内的重要大分子。有研究表明，脂磷壁酸能结合至巨噬细胞表面，激活巨噬细胞许多信号通路，分泌许多重要细胞因子，从而对巨噬细胞的吞噬能力产生促进作用。本研究探讨了双歧杆菌的脂磷壁酸对巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的激活作用。
1 材料与方法

1.1 材料

7～10周龄的Bal/c小鼠20只，其中，雄性10只，雌性10只，体重20～25 g。人体淋巴癌细胞传代于100 ml的胎牛血清培养液中，当它们贴壁生长成单层时，用胰蛋白酶消化[3]。TNF-α检测试剂盒为Sigma公司生产，细胞裂解液购自Bio-Rad公司，蛋白酶抑制剂购自Signalling公司。

1.2 方法

1.2.1 脂磷壁酸的提取 将双歧杆菌接种于LB培养基中，在37℃无氧环境中培养48 h。用离心机（12 000×g，15 min）收集细菌。将细菌置入裂解液中，裂解10 min，离心机（12 000×g，15 min）收集上清液。将上清液置入50℃的水浴锅中水源于：免费论文网www.7ctime.com
浴20 min，当溶液分成上下两层时，结束水浴。将上层溶液放入阴离子层析器中，再用醋酸铵缓冲溶液洗脱，此时脂磷壁酸吸附在洗脱柱上。将脂磷壁酸溶于缓冲液中，用分光光度计进行检测，无明显的核酸和蛋白质污染时，可以进行下一步实验[4]。
1.2.2 具体方法 将20只小鼠随机分成脂磷壁酸组（10只）和对照组（10只）。两组小鼠的性别、体重等方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。脂磷壁酸组小鼠每天空腹注射脂磷壁酸溶液（10 g/L）3 ml，对照组小鼠每天空腹注射缓冲溶液3 ml，两组均连续注射10 d。
1.2.3 巨噬细胞的提取和培养 10 d后将20只小鼠全部处死，提取小鼠腹腔液，用离心机（12 000×g，5 min）离心，收集沉淀细胞。将细胞培养于胎牛血清培养液中，连续培养48 h后，测定TNF-α活性。
1.2.4 TNF-α活性的测定 根据Giffords的方法，在培养板上加入小鼠的TNF-α作阳性对照，确定小鼠TNF-α活性单位数（U/ml），并作标准曲线。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对所有数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，两组间的相互比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
脂磷壁酸组小鼠的TNF-α为（78.45±34.21）U/ml；而对照组小鼠的TNF-α为（34.54±13.45）U/ml。两组间比较，差异有统计学意义（t=

2.18>

1.86，P<0.05）。

3 讨论 TNF-α主要由巨噬细胞产生[5]，脂多糖能刺激巨噬细胞产生TNF-α。TNF-α有许多生物学活性，能抑制和杀死肿瘤细胞。在机体内外TNF-α均能杀死许多肿瘤细胞，也能抑制肿瘤细胞的增生。不同的肿瘤细胞对TNF-α的敏感性有很大的差异，甚至TNF-α能对某些肿瘤细胞有刺激增生作用。目前对TNF-α杀死肿瘤细胞的机制还不甚清楚，主要的观点如下。①直接杀死肿瘤细胞：TNF-α与靶细胞受体结合后，进入到细胞内，与溶酶体结合，破坏溶酶体，使溶酶体稳定性降低，使各种酶外泄，导致细胞裂解。②调节机体的免疫功能：促进机体产生T淋巴细胞，从而杀伤肿瘤细胞。③作用于血管论文导读：
内皮细胞：使内皮细胞的血管功能紊乱，形成血栓，导致肿瘤组织血流供应阻断，使之缺氧而死[6]。④使细胞增殖：T细胞NHCⅠ类抗原表达是依靠TNF-α来促进的，TNF-α能增强T细胞增殖能力，使T细胞分泌细胞因子，如C淋巴因子；TNF-α也能增强刺激B细胞的增殖，促使B细胞分泌Ig；对于某些肿瘤细胞，TNF-α具有生长因子样作用[7]，与胰岛素等一同促进细胞的增殖。⑤促进原癌基因表达：TNF-α也能促进原癌基因的表达（如c-Fos），这些原癌基因能促进细胞的增值，使细胞周期快速转变。
只有TNF-α有活性才能行使生物学功能，目前研究比较多的是脂磷壁酸激活巨噬细胞产生TNF-α。有研究发现，将脂磷壁酸注射到肿瘤小鼠的腹腔内，能抑制小鼠体内癌细胞的生长，延长小鼠的生命，而未注射脂磷壁酸的肿瘤小鼠死亡较快。对小鼠血清进行测定发现，注射过脂磷壁酸的肿瘤小鼠TNF-α含量较未注射脂磷壁酸者要高，提示脂磷壁酸可能激活了巨噬细胞，促使其分泌大量的TNF-α来抵抗肿瘤细胞的生长[8]。目前对脂磷壁酸激活巨噬细胞产生TNF-α的机制解释如下：巨噬细胞表面可能有脂磷壁酸的受体，脂磷壁酸能识别这些受体，吸附在巨噬细胞上，导致细胞表面第二信号的传递，第二信号受体（如PKA蛋白）进入细胞核激活TNF-α基因转录蛋白，从而使TNF-α基因开始转录和翻译，产生TNF-α。TNF-α再进行细胞内运输，分泌到巨噬细胞外，行使抗肿瘤作用。
通过本研究，证明了双歧杆菌的脂磷壁酸确实能激活巨噬细胞产生TNF-α，从而为临床治疗提供了依据。
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（收稿日期：2013-03-19 本文编辑：袁 成）