阐释转导Smad7-siRNA对PC12细胞诱导神经细胞缺血影响生

论文导读：
摘要：缺血性脑卒中是危害人类健康的严重疾病，其防治策略和发病机制一直是国内外探讨的热点。缺血性脑损伤可发生复杂的信号转导通路的变化同时产生一定的生物学作用，由此，阐明与缺血性脑损伤有关的信号转导通路的变化，寻找通路中的关键作用靶点和可运用于临床的神经保护物质，进而在神经细胞缺血损伤后推动神经细胞功能的恢复，对缺血性脑卒中的治疗具有重要作用。Smad7属于I-Smad家族，在TGF-β信号通路中发挥抑制作用。Smad7是TGF-β作用的靶基因之一，可反馈调节TGF-β/Smad信号通路，维持该通路的平衡，Smad7能够与R-Smad（Smad2、Smad3）竞争性地结合被激活的TGF-β受体，以而阻止Smad2、Smad3与TGF-β受体结合及其随后的磷酸化历程。目前探讨表明，Smad7蛋白的高表达与胰腺癌、肝癌密切相关，还有探讨表明转染Smad7基因可显著抑制肾间质纤维化的进程，另有探讨表明，TGF-β超家族成员激活素A（ActA）/Smads通路的激活具有神经保护作用。Smad7作为一种信号蛋白在中枢神经系统有着其表达，Smad7在缺血性脑损伤中的变化规律和作用尚不明确，国内外未见报道。本探讨通过体外实验，探讨了Smad7对脑缺血损伤的作用和对ActA/Smads信号转导通路的影响。首先在体外建立由PC12细胞诱导的神经细胞氧糖剥夺（OGD）模型，同时靶向沉默Smad7，运用免疫荧光、Real time PCR和Westernblot技术对沉默效果进行检测，并运用Real time PCR，Western blot技术检测Smad7-siRNA对神经细胞缺血损伤时ActA/Smads信号转导通路的影响，运用DAPI、FCM、Western blot等技术检测并观察Smad7-siRNA对神经细胞缺血损伤细胞凋亡的影响。结果显示，PC12成功诱导分化为神经细胞，OGD模型成功制备；靶向沉默Smad7，缺血神经细胞中ActA表达增加，其下游转录共激活因子p300表达增加，ActA/Smads通路激活；Smad7-siRNA后神经细胞缺血损伤细胞凋亡减少。提示Smad7在脑缺血损伤中具有重要作用，Smad7-siRNA可增强ActA/Smads信号转导通路，降低神经细胞缺血损伤的细胞凋亡率。本探讨首次探讨了Smad7在神经细胞缺血损伤中的作用及分子机制，为探讨ActA/Smads信号转导通路在脑缺血损伤中的分子机制奠定基础，ActA/Smads信号转导通路在脑缺血损伤中具有重要作用，通路中主要位点及其调节蛋白可能成为缺血脑损伤机制探讨和治疗的新靶点。1. PC12细胞诱导的神经细胞OGD模型的制备和鉴定目的：制备神经细胞OGD模型，为后续实验奠定基础。策略：利用PC12细胞，经NGF（100ng/mL）刺激诱导1，2，3，4，5，6d后向神经细胞分化，6d后对分化细胞进行OGD（5%CO2and95%N2，1mmol/LNa2S2O4in sugar-free DMEM)3，6，9，12，16，24h，建立神经细胞OGD模型。采取形态学，免疫荧光，免疫印迹，FCM，DAPI等技术对此模型进行鉴定。结果：NGF（100ng/mL）体外诱导PC12细胞分化为神经细胞，MAP2蛋白表达呈动态变化；在体外成功建立神经细胞的OGD模型，细胞凋亡率和HIF-1基因表达随OGD时间呈动态变化。结论：NGF（100ng/mL）诱导PC12细胞6d，OGD（5%CO2and95%N2，1mmol/L Na2S2O4in sugar-free DMEM)16h可建立神经细胞OGD模型。2.靶向沉默Smad7基因及沉默效果的检测目的：对PC12细胞分化的神经细胞靶向沉默Smad7，同时进行沉默效果检测，筛选出最有效干扰序列，测试出最佳转染浓度和最佳的作用时间。策略：以Smad7基因为靶目标，设计合成3条siRNA序列，进行细胞转染，利用Real time-PCR和Western blot技术检测沉默效果，筛选出最有效的干扰序列，同时检测出最佳的转染浓度和转染时间。结果：针对Smad7基因设计合成及筛选靶向沉默Smad7基因的干扰序列（siRNA1）；siRNA1的最佳转染浓度是4μg/mL；siRNA1的最佳转染时间是24h；siRNA1对Smad7的抑制效果优于其它干扰序列。结论：siRNA1能有效沉默Smad7基因；ppofecta-mineTM2000可成功将siRNA1转染至神经细胞，转染效率较高，利用siRNA技术能有效抑制神经细胞Smad7基因表达。3. Smad7-siRNA对ActA/Smads信号转导通路的影响目的：探讨Smad7基因对ActA/Smads信号转导通路的影响。策略：在细胞培养，细胞分化6d，细胞转染（Smad7-siRNA）和OGD16h的基础上，采取Real time-PCR和Westhern blot技术检测ActA/Smads信号转导通路中上游信号蛋白ActA和下游信号蛋白转录共激活因子p300mRNA水平和蛋白水平的表达变化情况，观察Smad7基因对ActA/Smads信号转导通路的影响。结果：神经细胞缺血损伤后ActA，p300表达增加；Smad7-siRNA，神经细胞缺血损伤后ActA，p300蛋白因子表达进一步增加；Smad7-siRNA，可以增强ActA/Smads信号转导通路。结论：Smad7-siRNA后激活缺血神经细胞的ActA/Smads信号转导通路，其上游信号蛋白ActA和下游信号蛋白转录共激活因子p300表达均增加。4. Smad7-siRNA对神经细胞缺血细胞凋亡的影响目的：探讨Smad7基因对神经细胞缺血损伤细胞凋亡的影响。策略：在细胞培养、细胞分化6d、细胞转染（Smad7-siRNA）、OGD16h的基础上，采取FCM、DAPI、免疫印迹策略观察Smad7-siRNA对神经细胞缺血损伤后细胞凋亡率的变化、凋亡小体的变化和活化前凋亡蛋白（Procaspase-3）蛋论文导读：6-674.5小结674.6参考文献67-69第5章AD7-SIRNA对神经细胞缺血损伤细胞凋亡的影响69-775.1实验材料69-705.1.1主要试剂695.1.2主要仪器69-705.2实验策略70-715.2.1细胞培养，细胞分化及OGD模型制备705.2.2细胞转染705.2.3凋亡小体的检测（DAPI染色）705.2.4细胞凋亡检测（流式细胞仪检测）70-715.2.5Procaspase-
白表达的变化，探讨Smad7基因对神经细胞缺血损伤细胞凋亡的影响。结果：Smad7-siRNA可以降低神经细胞缺血损伤的细胞凋亡率；Smad7-siRNA可上调缺血性神经细胞中的Procaspase-3蛋白表达。结论：Smad7-siRNA可通过Smads信号转导通路，影响细胞凋亡及凋亡调控基因的表达对脑缺血损伤具有保护作用。关键词：氧糖剥夺论文缺血性脑损伤论文Smad7论文Smads信号转导通路论文
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Abstract7-14
英文缩略词表14-15
第1章 绪论15-29

1.1 SIRNA 技术探讨进展15-18

1.1 siRNA 的设计15-16

1.2 siRNA 的合成16

1.3 siRNA 导入细胞内的策略16-17

1.4 siRNA 技术的运用17-18

1.5 不足与展望18

1.2 ADS 蛋白的探讨进展18-22

1.2.1 Smads 蛋白家族的结构与功能18-19

1.2.2 Smads 与细胞增殖19

1.2.3 Smads 与心血管疾病19-20

1.2.4 Smads 与凋亡20-21

1.2.5 Smads 与血管平滑肌细胞21

1.2.6 Smads 与神经系统21-22

1.2.7 展望22

1.3 参考文献22-29

第2章 PC12 细胞诱导的神经细胞 OGD 模型的制备和鉴定29-45

2.1 材料和策略29-34

2.

1.1 实验细胞29

2.

1.2 主要试剂29-30

2.

1.3 主要仪器30

2.

1.4 实验策略30-34

2.2 结果34-41

2.1 形态学观察34-36

2.2 PC12 细胞转化为神经细胞的的鉴定36-38

2.3 神经细胞 OGD 模型的制备及鉴定结果38-41

2.3 讨论41-43

2.4 小结43

2.5 参考文献43-45

第3章 靶向沉默 AD7 基因及沉默效果的检测45-61

3.1 材料和策略45-51

3.

1.1 实验材料45-46

3.

1.2 实验仪器46

3.

1.3 主要溶液的配制46-47

3.

1.4 实验策略47-51

3.

1.5 统计学处理51

3.2 结果51-56
3.

2.1 转染效率检测结果51-52

3.

2.2 MTT 法细胞存活率检测52-53

3.2.3 Real time-PCR 测定 Smad7 基因 mRNA 的表达53-55
3.

2.4 Western blot 检测 Smad7 基因蛋白表达55-56

3.3 讨论56-57

3.4 小结57

3.5 参考文献57-61

第4章 AD7-SIRNA 对 ACTA/ADS 信号转导通路的影响61-69

4.1 实验材料61-62

4.

1.1 主要试剂61-62

4.

1.2 主要仪器62

4.2 实验策略62-65
4.

2.1 细胞培养、细胞分化及 OGD 模型制备62

4.

2.2 细胞转染62-63

4.2.3 Smad

7、ActA、p300 mRNA 检测（Real time PCR）63-64

4.2.4 免疫印迹检测 Smad

7、ActA、p300 蛋白表达64-65

4.2.5 统计学处理65

4.3 结果65-66

4.3.1 Real time-PCR 检测 Smad

7、ActA、p300 mRNA 表达65-66

4.3.2 免疫印迹检测 Smad

7、ActA、p300 蛋白表达66

4.4 讨论66-67

4.5 小结67

4.6 参考文献67-69

第5章 AD7-SIRNA 对神经细胞缺血损伤细胞凋亡的影响69-77

5.1 实验材料69-70

5.

1.1 主要试剂69

5.

1.2 主要仪器69-70

5.2 实验策略70-71
5.

2.1 细胞培养，细胞分化及 OGD 模型制备70

5.

2.2 细胞转染70

5.

2.3 凋亡小体的检测（DAPI 染色）70

5.

2.4 细胞凋亡检测（流式细胞仪检测）70-71

5.

2.5 Procaspase-3 蛋白检测（免疫印迹）71

5.

2.6 统计学处理71

5.3 结果71-73
5.

3.1 凋亡小体检测71-72

5.

3.2 FCM 检测细胞凋亡72-73

5.

3.3 免疫印迹检测 Procaspase-3 蛋白表达73

5.4 讨论73-75

5.5 小结75

5.6 参考文献75-77

结论77-79
攻读博士期间获得的成果79-80
致谢80