微针技术结合乙醇脂质体促进重组人酸性成纤维细胞生长因子透皮吸收研究-经典

论文导读：　为了促进酸性成纤维细胞生长因子在外用给药时可以穿过角质层有效地进入真皮层内，我们将近年来在经皮给药中具有优良促渗作用的先进技术一乙醇脂质体载体技术与微针技术相结合，使两种方法共同作用，扬长避短，促进酸性成纤维细胞生长因子有效、大量地透过角质层。同时本实验也为大分子蛋白、多肽类物质外用给药提供了一种新的
[摘要]目的：探索rhaFGF透皮给药微创有效的给药方式。方法：离体实验：亚甲蓝染色经微针处理后的离体兔皮，观察微孔的分布和排列。冰冻切片HE染色观察微孔的深度。在体实验：新西兰大白兔分别分为微针+空白脂质体组、微针+rhaFGF组、微针+rhaFGF乙醇脂质体组、皮内注射组；时间和浓度一定时，皮肤组织切片免疫荧光、免疫组织化学染色观察rhaFGF的分布，ELIsA法检测皮肤组织匀浆液中rhaFGF的含量，经统计后分析不同给药方式中药物经皮渗透效果最好的一组。结果：微针处理后离体兔皮微孔排列均匀，深度可达真皮层。动物给药30min后，微针+rhaFGF组、微针+rhaFGF乙醇脂质体组及皮内注射组皮肤组织匀浆液中rhaFGF含量均高于微针+空白脂质体组，差异均有统计学意义(P<0.05)；微针+rhaFGF乙醇脂质体组高于微针+rhaFGF组皮肤组织匀浆液中rhaFGF含量，差异有统计学意义(P0.05)。rhaFGF免疫荧光、免疫组化染色显示，微针+rhaFGF乙醇脂质体组真皮组织中有大量rhaFGF存在，且分布均匀；结论：本文的研究结果表明微针技术结合乙醇脂质体能取得较高的rhaFGF透皮效果，使rhaFGF外用给药促进皮肤增殖，加速皮瓣扩张成为可能。此方法简单易行，同时也为其它蛋白、多肽类大分子药物的经皮给药研究提供了新思路。
[关键词]重组人酸性成纤维细胞生长因子；乙醇脂质体；微针阵列；经皮给药
[]A　[文章编号]1008-6455(2012)07-1159-04
因大面积烧伤、创伤等因素引起的皮肤组织的缺损通常需要再生皮肤组织进行修复，目前可选用的方法有异体组织移植、组织工程、自体皮肤扩张转移等，虽然异体组织移植、组织工程具有潜在的治疗前景，但是目前仅有自体组织扩张术可再生出具有完全生理功能的皮肤组织。由于扩张产生的皮肤颜色、质地、结构和毛发均与受区相近似，是理想修复材料，并且扩张产生的皮瓣多数能保存感觉神经，供区继发畸形小，具有其它治疗方法不可比拟的优点，因此对于某些疾患如面颈部瘢痕的治疗，皮肤扩张术已成为首选的治疗方法。然而该技术存在治疗周期长，再生皮肤有限，患者经济负担较重等缺陷。目前人们也尝试了各种办法加速皮肤组织的生长，但是并没有取得理想的效果。本研究旨在寻找一种新的、简单易行的方法，加速皮肤组织再生，从而缩短治疗周期，减轻患者负担。
酸性成纤维细胞生长因子(acidic Fibroblast GrowthFactor，aFGF)是一种广谱促分裂原，对来源于中胚层及神经外胚层的细胞具有促增殖作用，能够促进皮肤组织生长、新生血管形成。但是，目前尚没有aFGF的外用制剂可以使aFGF穿透皮肤角质层进入到皮肤组织内。
微针阵列(microneddle array，简称微针)是近年来兴起的一种新型的给药方式，它利用微针组成的阵列可以在皮肤上人为造成数百上千条微米级的通道。这种通道是可见的，要比分子的尺寸大得多，并且通过角质层延伸至表皮内部，因此它可以很容易地让大分子物质通过；但是它并不会在皮肤上形成明显的伤痕，通道一般也不触及神经及血管，在使用过程中不会引起疼痛感。目前微针在经皮给药领域中的应用受摘自：7彩论文网学术论文格式www.7ctime.com
到了广泛关注。
微针促渗技术尽管在很大程度上减小了角质层的传导阻力，但是大分子多肽、蛋白类物质的经皮传导仍是依靠浓差推动的被动扩散来实现的，由于药物滞留、浓差极化、药物在油水相分配系数的影响，渗透量仍然较低。要进一步提高药物的经皮渗透量，必须强化药物的被动扩散，这可以通过改善药物在临时的局部传输区域、皮肤组织和组织液问的分配系数，增加新的推动力来实现。乙醇脂质体是一种生物相容性很好的表面活性剂，可改善大分子多肽、蛋白类药物在皮肤中的分配系数，使药物的经皮渗透性获得显著提高。
为了促进酸性成纤维细胞生长因子在外用给药时可以穿过角质层有效地进入真皮层内，我们将近年来在经皮给药中具有优良促渗作用的先进技术一乙醇脂质体载体技术与微针技术相结合，使两种方法共同作用，扬长避短，促进酸性成纤维细胞生长因子有效、大量地透过角质层。同时本实验也为大分子蛋白、多肽类物质外用给药提供了一种新的方法。
1材料和方法
1.1材料：新西兰大白兔8只，清洁级，雌雄不限，5～6月龄，体重3.50～4.50kg，由中国医学科学院整形外科医院动物实验中心提供，采用复层活动式兔笼笼养，饲养条件遵照国家相关规定和基本要求。饲养亦是由中国医学科学院整形外科医院动物实验中心提供：购入后常规混合饲料喂养2周，无异常情况及病症即投入使用。微针治疗系统(长度1000μum，阵列密度均为30针／cm2，广东高要市奇福微针有限公司)。重组人酸性成纤维细胞生长因子(recombinant humanacidic Fihroblast Growth Factor，rhaFGF)(艾夫吉夫，上海万盛生物技术有限公司免费提供)。
L 2离体实验
1.2.1微孔分布的观察：新西兰白兔2只，处死后取新鲜全厚兔皮，剃毛，用大头钉固定于平木板上，保持自然张力，用微针处理后亚甲蓝染色，10min后自来水冲洗、擦干，观察微孔的分布，拍照记录。
1.2.2微孔深度的测量和组织学观察：将微针处理的离体兔皮，浸入OCT液中，存储于-80℃低温冰箱过夜，次日用低温冷冻切片机切片(厚5μm)，HE染色，光学显微镜下观察微针针道，并随机选取50个针道测量其深度，求(x±s)，显微成像系统拍照记录。

1.3在体实验

1.3.1实验动物预处理：术前1天，取新西兰大白兔，在局麻下，用刀片剔去大白兔背部毛发。
1.3.2实验动物分组：新西兰白兔6只，麻醉，碘伏消毒2遍，取背部正中线，双侧对称位置分别标记2cm×2cm大小的4块皮肤。随机分配给微针+空白脂质体组、微针+rhaFGF组、微针+rhaFGF乙醇脂质体组、皮内注射组，共四组，每组1块皮肤组织，6只兔，共48块皮肤组织，每组分获12块皮肤组织。①微针+空白脂质体组：每2cmX 2cm皮肤用微针交叉滚动2遍后涂布空白脂质体：②微针+rhaFGF溶液组：论文导读：
每2cm×2cm皮肤用微针交叉滚动2遍后涂布浓度为0.06mg／ml rhaFGF溶液；③微针+rhaFGF乙醇脂质体组：每2cm×2cm皮肤用微针交叉滚动2遍后涂布浓度为0.06mg／ml rhaFGF乙醇脂质体；④皮内注射rhaFGF组：每2cmX2cm皮内多点注射浓度为0.06mg／ml rhaFGF溶液。切取标记内皮肤及皮下组织，部分标本用OCT液包埋，切片，aFGF免疫荧光染色，荧光显微镜下观察rhaFGF在皮肤组织中的分布；部分标本用10％甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，aFGF免疫组化染色，苏木素复染，光学显微镜下观察rhaFGF在皮肤组织中的分布；1cm×1cm皮肤组织ELISA法检测皮肤匀浆液中rhaFOF的含量，分析药物渗透进入皮肤组织内的量，样品组中微针+rhaFGF、组微针+rhaFGF乙醇脂质体组、皮内注射组稀释十倍后再进行检测。
1.3.3统计学方法：采用SPSS统计软件进行统计学分析。首先采用重复测量的方差分析进行各个数据比较，不同组样本进行配对t检验。数据以均值±标准差(x±S)表示，设P<0.05为有统计学差异。
2结果
2.1大体观察：微针处理的兔皮经亚甲蓝染色后，微孔被染成蓝色，清晰、均匀分布，排列规则(图1A，1B)。
2.2离体组织HF染色：光镜下可见微针处理后的兔皮角质层被刺穿，产生的微孔到达真皮层，平均深度(178±24)μm(图2)。
2.3免疫组化、免疫荧光染色结果：经皮给药30min后，微针+rhaFGF乙醇脂质体组可见兔皮肤真皮层大量的rhaFGF均匀分布，越靠近角质层含量越高(图3C1，C2)；皮内注射组可见皮肤组织较为疏松，皮肤组织真皮层大量的rhaFGF，但分布并不均匀(图3D1，D2)；微针组+rhaFGF溶液组可见有较少量rhaFGF(图381，B2)；微针+空白脂质体组未见rhaFGF(图3A1，A2)。
2.4 ELISA结果：给药30min后，微针+rhaFGF组、微针+rhaFGF乙醇脂质体组及皮内注射组皮肤组织匀浆液中rhaFGF含量均高于微针+空白脂质体组，差异均有统计学意义(P<0.05)；微针+rhaFGF乙醇脂质体组高于微针+rhaFGF组皮肤组织匀浆液中rhaFGF含量，差异有统计学意义(P0.05)(表1)。
3讨论
3.1皮肤角质层是药物透皮的主要屏障，仅允许分子量在500Da以下的脂溶性药物扩散，如何使大分子物质突破角质层的限制成为药物透皮研究的重点及热点。近年发展的经皮微针给药技术，可以在角质层产生大量的亲水性微通道，使直接涂布无法透过的大分子亲水性药物到达真皮组织，是一种无痛微创高效的新兴源于：7彩论文网论文格式怎么写www.7ctime.com
透皮技术。
3.2微针的长度是引起疼痛刺激的主要因素。有研究表明，在正常皮肤上，长度1500μm微针的疼痛刺激仅为26G微量注射针头的35％。本实验冰冻切片观察到，1000μm微针处理后的离体皮肤平均深度为平均深度(178±24)μm，可能是由于皮肤的弹性回缩作用和滑动作用消减了微针的穿透力，使微针不能全部进入皮肤到达皮肤深层引起疼痛刺激。微针经皮促透给药不会引起疼痛刺激，相对于皮射是一种无痛、微创、安全可靠的方法。同时rhaFGF有促进创面愈合的作用，可能会加速小针道的愈合及收缩，减轻疼痛刺激。
3.3含醇脂质体，又称乙醇脂质体，是近年来颇受药学和皮肤领域关注的新型的柔性脂质体，乙醇脂质体药物透皮给药系统是药剂学中的新兴研究领域。乙醇脂质体与普通脂质体的主要区别在于乙醇包含在脂质体囊泡中，没有胆固醇的成分。磷脂是乙醇脂质体双分子层结构中的主要化学成分，同时脂质体含有相对较高体积分数的乙醇(约20％～50％)。乙醇的存在，降低了乙醇脂质体囊泡的表面张力，增强脂质体的柔性：另一方面，乙醇取代了脂质双分子层头基附近的水分，从而提高其流动性；乙醇分子也改变角质层间磷脂分子的紧密排列。角质层磷脂双分子层被改变结构后容易与乙醇脂质体囊泡的磷脂双分子层相互融合，此时乙醇脂质体囊泡将包封的药物胞吐进入细胞间磷脂双分子层；同时乙醇脂质体也可以改变其形状，以适应变形的磷脂双分子层的孔径，然后渗透到达表皮或者真皮层。皮肤的附属结构毛囊和皮脂腺本身形似腔隙样结构，乙醇脂质体囊泡本身可以变形成为细长结构，然后通过毛囊皮脂腺单位。
3.4在乙醇脂质体制备时，首先乙醇与磷脂相互作用，磷脂完全溶解在乙醇溶液中，磷脂分子充分伸展。当加入药物时，随着水相增加，乙醇所占比例的减少，磷脂分子自动排列形成单层片状的有序结构；当乙醇所占比例进一步减少，两个磷脂分子侧链便会相互交错起来，使得大的片层结构闭合起来形成了脂质体囊泡。乙醇脂质体包裹rhaFGF进入脂质囊泡后，可有效避免rhaFGF与外界环境的直接接触，对rhaFGF起到较好的保护作用。脂质囊泡具有贮存药物的作用，制成rhaFOF乙醇脂质体后给药，脂质体外的游离的rhaFGF先发挥作用。之后，脂质体囊泡中包裹的药物从其中释放，再次发挥药效。通过两次释药，脂质体可以实现缓释给药的作用。实验证明，与脂质体相比乙醇脂质体促药物透皮吸收的效果更好。
3.5乙醇脂质体除了具有一般脂质体可生物降解，无毒性，不产生皮肤刺激性的优点外，还具有以下功能：①可以与生物的细胞膜融合，将包裹的内容物传递进入细胞膜内；②易于变形从而穿透皮肤屏障的各种孔隙，如穿透角质层间的磷脂层以及毛囊皮脂腺等；③乙醇脂质体是一个离子型表面活性剂，具有亲油亲水性，可以有效地包封各种化合物(脂溶性、水溶性分子包括蛋白质多肽类分子)渗透到达皮肤深层。
3.6微针技术尽管在很大程度上减小了角质层的传导阻力，但是大分子多肽、蛋白类物质的经皮传导仍是依靠浓度差推动的被动扩散实现的，由于药物滞留、浓差极化、药物在油水相分配系数的影响，药物的渗透量仍然较低。磷脂是一种生物相容性很好的表面活性剂，可改善大分子多肽、蛋白类药物在皮肤中的分配系数，使药物的经皮渗透性获得显著提高。本研究通过在体皮肤组织实验可知：在微针的帮助下药物可以透过皮肤层，微针+rhaFGF溶液组rhaFGF可以通过微针通道进入真皮层，分布论文导读：重点。乙醇脂质体载体技术是近年来颇受药学和皮肤领域关注的新型药物载体，微针技术是物理经皮给药中具有优良促渗作用的先进技术。将乙醇脂质体载体技术与微针技术相结合，扬长避短，发挥最大的功效，从而取得较高的透皮速率。上一页123
也较均匀，但是数量较少。注射组真皮中有大量的rhaFGF，主要聚集在注射点周围，分布不均匀。而微针+rhaFGF乙醇脂质体组不仅毛囊和腺体中有rhaFGF，而且真皮层也有大量的rhaFGF均匀分布，提示微针与乙醇脂质体联合作用对rhFOF经皮给药的促透作用极佳。皮肤组织匀浆液中rhFGF含量测定结果进一步证实，微针+rhaFGF乙醇脂质体组具有与皮内多点注射组相当的透皮效率，较微针+rhaFOF溶液组高，且差别显著。微针技术与乙醇脂质体载体技术相结合，发挥最大的功效，取得了较高的透皮速率。
3.7大分子物质尤其是蛋白质多肽类大分子物质透皮吸收一直是人们研究的重点。乙醇脂质体载体技术是近年来颇受药学和皮肤领域关注的新型药物载体，微针技术是物理经皮给药中具有优良促渗作用的先进技术。将乙醇脂质体载体技术与微针技术相结合，扬长避短，发挥最大的功效，从而取得较高的透皮速率。