简述胶质活化小胶质细胞在急性脑梗死中作用及其机制

论文导读：增殖与分化密切相关。许多探讨揭示磷酸化的ERK1/2主要表达于脑梗死后梗死皮层周围的神经元内,也有文献报道脑缺血的刺激可引起MG内的ERK1/2磷酸化,活化后的ERK1/2推动了MG合成和分泌BDNF。脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是神经营养因子家族的成员之

一、除分布于中枢神经和感觉神经从外,还分布于

摘要：探讨背景与近况脑血管疾病(cerebrovascular disease, CVD)作为神经体系较为常见的疾病,是主要的公共健康不足之一。脑梗死又称缺血性卒中,是指各种理由所致脑部血液供应障碍,导致脑组织缺血、缺氧性死亡,并出现相应的神经功能缺损的疾病。脑梗死是脑血管病的常见类型,约占全部脑血管病的80%,是继心脏病后又一种高致死性的疾病。既使有些病人幸存下来也遗留了严重的后遗症,给家庭和社会带来沉重的负担,而随着老龄化社会的到来,缺血性脑病的发病率也在逐年增多,由此,寻找一种安全而有效的治疗办法成为当今医学界探讨的热点内容。关于脑梗死的病理变化,目前多数学者认为脑部的急性缺血缺氧所导致的小胶质细胞的活化,炎症因子、兴奋性氨基酸的释放,氧自由基的产生等这些因素是造成脑损伤的重要理由,但具体的意义机制仍不清楚。小胶质细胞(Microgpa, MG)是脑内主要的免疫细胞,具有营养、保护和修复神经元的意义。静止的MG发挥了免疫监视意义,而活化的MG在中枢神经体系疾病中的意义仍有着较大的争议。从前大量的体外探讨显示MG在中枢神经体系疾病中发挥着神经损害的意义,而近些年来的体内探讨却显示活化的MG不仅分泌神经营养因子,还抑制了神经元的凋亡,因而具有神经保护意义。由此,明确小胶质细胞在脑梗死中的意义将有助于解释该病的病理历程并且有助于寻找新的治疗办法,所从有必要对MG功能进行深入探讨,从期明确活化MG在神经体系疾病中的确切意义及机制。细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)分为ERK1和ERK2,统称为ERK1/2。ERK是一丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的一个重要成员,广泛地参与了以细胞的代谢、活力及炎症反应到细胞死亡与存活的调节。脑梗死后的生长因子或细胞因子的刺激可从经细胞表面的MAPK的方式将其磷酸化而激活,活化后的ERKl/2大部分转移至细胞核内,推动某些基因的转录与表达,与细胞的增殖与分化密切相关。许多探讨揭示磷酸化的ERK1/2主要表达于脑梗死后梗死皮层周围的神经元内,也有文献报道脑缺血的刺激可引起MG内的ERK1/2磷酸化,活化后的ERK1/2推动了MG合成和分泌BDNF。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经营养因子家族的成员之一,除分布于中枢神经和感觉神经从外,还分布于脊髓的运动神经元等。由于人们认识到BDNF在神经疾病中的重要意义,所从对其的功能进行了广泛的探讨,许多探讨结果提示BDNF不仅对神经元的存活、增殖、生长与分化从及维持正常的神经元功能起着重要的意义,而且还增多了神经元对伤害性刺激的耐受性,推动神经元再生等意义,但目前更多学者公认的BDNF神经保护机制是关于BDNF在拮抗兴奋性氨基酸毒性,稳定细胞内钙离子浓度中的意义。探讨表明BDNF可抑制Ca2+内流和细胞内钙离子的释放,BDNF可增多在海马内的含钙结合蛋白的神经元数量,而含钙结合蛋白的神经元较不含钙结合蛋白的神经元具有更好的抵抗谷氨酸毒性和抑制细胞内Ca2+升高的能力,由此BDNF可通过增多细胞内钙结合蛋白来稳定细胞内钙离子的浓度。Calbindin-D28k是钙结合蛋白的重要成员,其在脑血管疾病中的意义日益受到人们的重视,许多探讨发现Calbindin-D28k有着于神经元中,却没有参与神经体系的信号传递,提示该蛋白通过对细胞外钙离子浓度的调节参与了神经元的某些生理功能,可能在突触的关系中发挥了一定的意义,使神经元免于遭受由电压差所引起的细胞内钙超载；Calbindin-D28k可与钙离子高亲和力地结合以而缓冲了钙离子在细胞内快速地增多,并参与了钙离子的运输,阻止钙离子过度地蓄积,以而保持了钙离子浓度的相对稳定。这些结果均提示Calbindin-D28k在脑损伤后通过抑制钙离子的浓度过高而发挥神经保护意义。另外,进一步的探讨发现Calbindin-D28k能激活Ca2+/Mg2+-ATP酶活性,阻止脑内Ca2十过度蓄积。Calbindin-D28k缓冲神经元内过高的钙离子浓度和运输细胞内异常升高的Ca2+是维持钙离子稳态不可缺少的重要因素。还有很论文导读：TTC)法测量脑梗死的体积。结果：细胞标记的结果显示：于CFDA-SE标记后的12h可在荧光显微镜下观察到带有很强绿色荧光信号的小胶质细胞,并且该荧光信号一直持续到第7天,说明该标记液达到了本实验的要求,另外,MTT法检测显示CFDA-SE并没有影响小胶质细胞的生长与增殖。脑组织的冰冻切片显示在移植后的12h,带有荧光信号的小胶质细胞
多文献报道钙结合蛋白通过它的缓冲钙的意义,能够明显地减轻缺血缺氧引起的神经细胞的损伤。另外,Calbindin-D28k另一个神经保护机制可能与与抑制钙蛋白酶活性有关,因为在急性脑梗死后,大量的钙离子开始进入神经细胞内,以而激活了钙蛋白酶。活化的钙蛋白酶可将神经元内的膜收缩蛋白(a-spectrin,神经元的基本结构单位)水解为分子量为145和150KDa的蛋白质片段,以而造成神经元的坏死。既然MG在缺血性脑病中发挥了重要意义,而其在脑梗死特别是急性脑梗死中的意义极为意义机制仍不清楚,由此有必要在体内进一步探讨MG的意义及意义的分子机制,从期为脑梗死的治疗提供新的治疗途径与靶点。目的：为体内探讨活化小胶质细胞在急性脑梗死中的意义提供纯化的种子细胞。办法：取胎龄14天的昆明小鼠大脑,采取改良的胰蛋白酶预消化加轻拍打法提取和纯化小胶质细胞,然后采取免疫细胞化学办法检测细胞质表面的抗原标记,采取流式细胞技术检测细胞的纯度。将经过纯化的小胶质细胞进行传代培养。结果：原代培养的结果显示经改良后的McCarthy法即胰蛋白酶预消化加轻拍打法所纯化的细胞数量较多,且细胞免疫化学法检测显示多为CD68和CDllb阳性细胞,流式细胞技术检测显示改良后的胰蛋白酶预消化加轻拍打法所收集到的CDllb阳性细胞所占细胞总数的百分比超过了92%,而传统的McCarthy办法收集的CDl1b阳性细胞纯度只有80%,并且两种纯化办法所收集的CD11b阳性细胞的纯度有明显的统计学差别(p0.05),由此,经改良的McCarthy办法分离纯化的细胞达到了实验要求,可从作为种子细胞进行从下实验。结论：胰蛋白酶预消化加轻拍打法可从分离纯化到纯度较高、数量较多的小胶质细胞。目的：体内探讨活化小胶质细胞在大体水平对脑梗死急性期小鼠的神经功能和梗死体积的影响。办法：采取羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)液对小胶质细胞进行标记,并于标记后12、24和72h及7d在荧光显微镜下观察荧光信号,随后用3-(4,5-二噻唑-2)-2,5-二四氮唑溴盐(MTT)法检测CFDA-SE对小胶质细胞生长及增殖的影响。采取线栓栓塞大脑中动脉(MCAO)办法制做脑梗死动物模型；在观察荧光信号达到实验要求的72h后,将CFDA-SE标记的小胶质细胞经锁骨下静脉注入到MCAO小鼠体内,并分别于移植后的12、24和72h取小鼠大脑做冰冻切片从观察小胶质细胞在脑内的分布与数量。完成上面陈述的的细胞标记与示踪实验后,将66只清结级昆明小鼠随机分为四组：A组(MCAO+小胶质细胞移植,小胶质细胞移植组),B组(MCAO+MG培养基,安慰剂组),C组(MCAO组,空白对照组),D组(假手术+小胶质细胞移植,假手术组),其中A组MCAO小鼠在术后12h接受50ì1小胶质细胞悬液(1×105/μ1)；B组MCAO小鼠在术后12h接受与A组相同体积的培养基；C组小鼠在经MCAO术未接受任何处理；D组小鼠在经假手术12h后接受了与A组相同体积的小胶质细胞悬液。然后分别于小胶质细胞移植后的12、24和72h采取Zea-longa和圆筒试验对各组小鼠进行神经功能评分,随后处死小鼠后取脑,采取2%红四氮唑(TTC)法测量脑梗死的体积。结果：细胞标记的结果显示：于CFDA-SE标记后的12h可在荧光显微镜下观察到带有很强绿色荧光信号的小胶质细胞,并且该荧光信号一直持续到第7天,说明该标记液达到了本实验的要求,另外,MTT法检测显示CFDA-SE并没有影响小胶质细胞的生长与增殖。脑组织的冰冻切片显示在移植后的12h,带有荧光信号的小胶质细胞开始在MCAO小鼠脑内出现,在移植后的72h显著增加,并且主要集中在脑梗死周围。神经功能评定显示与安慰剂B组和空白对照C组相比,MG移植A组小鼠Zea-longa评分降低,患侧前肢首次接触瓶壁的次数也显著增多,并且在统计学上有明显的差别(p0.05)。TTC染色显示A组小鼠的梗死体积明显小于B和C组小鼠(p0.05)。结论：CFDA-SE标记液能够对小胶质细胞进行绿色荧光标记,并且标记的荧光信号能够维持到标记后的第7天而没有影响小胶质细胞的生长与增殖；体外移植的带有绿色荧光信号的小胶质细胞能够通过血脑屏障到达MCAO小鼠脑内,并且在移植后72h在脑梗死周围显著增加；体外移植的论文导读：
活化小胶质细胞改进了MCAO小鼠前肢的神经功能,减小了梗死体积。目的：在组织及分子水平探讨小胶质细胞是否影响了脑梗死急性期神经元的死亡和相关细胞因子的释放。办法：25-35g清洁级雄性昆明小鼠264只。动物的分组及处理同第二章的实验内容。分别于小胶质细胞移植后的12h、24h和72h采取过量麻醉办法处死小鼠并取脑,然后采取HE染色法检测坏死的神经细胞,采取TUNEL染色法检测凋亡的神经细胞,采取免疫组织化学办法检测脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)等细胞因子及微管相关蛋白(MAP2)的表达,采取免疫荧光双染法检测了磷酸化的细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)在神经细胞、小胶质细胞和星型胶质细胞内的表达,另外,采取western blot办法检测了神经细胞的裂解的膜收缩蛋白(cleed α-spectrin,神经元的骨架结构)的表达。结果：在小胶质细胞移植后的24和72h与B和C组小鼠相比,A组小鼠的HE阳性细胞数量显著减少,而TUNEL阳性细胞、GDNF、TNF-α和IL-1β阳性细胞却无明显的增多或减少,BDNF和MAP2的阳性细胞数量明显地增多,另外,cleed α-spectrin(分子量为145KDa)的表达水平也显著升高。免疫荧光双染显示p-ERK1/2除少量表达于小胶质细胞外,还大量地表达于神经细胞核。结论：活化小胶质细胞抑制了神经细胞的坏死并有助于神经细胞的生存,推动了BDNF及p-ERK1/2的表达,但并没有影响神经细胞的调亡和TNF-a、IL-1β和GDNF的表达。目的：探讨活化小胶质细胞在脑梗死急性期对P-ERK1/2表达的影响极为影响的作用,为活化小胶质细胞的神经保护机制提供了论述依据。办法：198只清洁级昆明小鼠被随机分为四组：A组(MCAO+小胶质细胞移植,小胶质细胞移植组),B组(MCAO+小胶质细胞移植+U0126,U0126抑制剂组),C组(MCAO,对照组),D组(假手术组),其中A和B组MCAO小鼠在术后12小时接受50μl小胶质细胞悬液(1×105细胞/μ1)的移植；B组小鼠在术后接受一定剂量的U0126溶液；C组小鼠在手术后未接受任何处理。在建立脑梗死或者假手术模型后,立即将U0126溶液按照30mg/kg的剂量经腹腔注入B组小鼠,从后每6小时注射1次直到实验完成,从维持一定的血药浓度。分别于小胶质细胞移植后的12、24和72h取脑,采取免疫组化办法检测BDNF阳性细胞数量,采取RT-PCR办法在基因水平检测BDNF及钙结合蛋白酶D28K(Calbindin-D28K)在各组的表达,采取western-blot办法检测了P-ERK1/2、ERK1/2、BDNF、Calbindin-D28k和cleed-a-spectrin的表达。结果：与B和C组小鼠相比,A组小鼠脑内的p-ERK1/2的蛋白表达水平和BDNF阳性细胞数量在移植后24和72h明显增多(P0.05)。Rt-PCR和western-blot检测结果显示A组小鼠脑内BDNF的表达水平在移植后24和72h明显高于B和C组小鼠(P0.05),但A组Calbindi-D28k表达的时间较晚,在移植后72h才与B和C组有明显差别(P0.05)。另外,在移植后的72h,A组小鼠脑内a-spectrin(分子量为145KDa)裂解片段的蛋白表达水平明显低于B和C组(P0.05),而B和C组小鼠脑内a-spectrin(分子量为145KDa)裂解片段的蛋白表达水平却无明显差别(P0.05)。结论：活化小胶质细胞在脑梗死急性期通过p-ERK1/2信号通路推动了神经细胞内的BDNF的表达,进而BDNF推动了Calbindin-D28k蛋白的表达,最终抑制了神经细胞的坏死。关键词：小胶质细胞论文分离论文纯化论文培养论文鉴定论文小胶质细胞论文羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯论文脑梗死论文神经功能论文小胶质细胞论文急性脑梗死论文脑源性神经营养因子论文磷酸化的细胞论文外信号调节激酶论文1/2论文小胶质细胞论文脑源性神经营养因子论文Calbindin-D28k论文论文导读：57-58第三章：活化小胶质细胞在组织及分子水平对脑梗死急性期小鼠的影响58-82前言58-59材料与办法59-67结果67-75讨论75-81小结81-82第四章：活化小胶质细胞对脑梗死急性期P-ERK1/2表达的影响与作用82-103前言82-84材料与办法84-90结果90-97讨论97-102小结102-103全文总结103-104参考文献104-113综述小胶质细胞在缺血性脑病病
磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2论文裂解的α-spectrin论文
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Abstract10-17
目录17-19
中英文缩略词表19-21
引言21-24
第一章：小胶质细胞的分离、培养、纯化与鉴定24-39
前言24
材料与办法24-30
结果30-33
讨论33-38
小结38-39
第二章：活化小胶质细胞对脑梗死急性期小鼠的神经功能和梗死体积的影响39-58
前言39-40
材料与办法40-46
结果46-50
讨论50-57
小结57-58
第三章：活化小胶质细胞在组织及分子水平对脑梗死急性期小鼠的影响58-82
前言58-59
材料与办法59-67
结果67-75
讨论75-81
小结81-82
第四章：活化小胶质细胞对脑梗死急性期P-ERK1/2表达的影响与作用82-103
前言82-84
材料与办法84-90
结果90-97
讨论97-102
小结102-103
全文总结103-104
参考文献104-113
综述 小胶质细胞在缺血性脑病病理历程中的意义113-124
参考文献120-124
在校期间发表学术论文及成果124-125
致谢125