探讨突触先天性巨结肠（Hirschsprungsdisease）中Neurexin、Neuroligin蛋白表达变化及生长素Ghrelin表达对巨结肠形成病
最后更新时间：2024-03-04
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论文导读：
摘要：先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)又称结肠无神经节细胞症,是一种常见且严重的小儿先天性畸形,其发病率高达1/3000-1/5000,居小儿消化道畸形的第二位。其主要的病理变化为远端结肠肠壁内神经节细胞的缺如或功能异常,导致病变肠段持续性痉挛,成狭窄状态,粪便淤积于近端结肠,导致近端结肠代偿性肥厚、扩张。目前对先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)的病因探讨表明多种基因因素和环境因素共同意义而导致疾病的形成。探讨表明,多种基因参与调控肠壁内神经节细胞发育,目前已知的基因有RET基因,EDNRB基因与ED3基因,GDNF基因,Bcl-2基因等.这些基因的异常可能是HD发病的分子机制。与此同时,如细胞外基质,细胞粘附分子、缺氧和毒素、炎症等胚胎肠道神经发育的环境缺陷,也有可能参与了HD的发病。总之先天性巨结肠的病因是由遗传因素和环境因素共同参与意义,最终导致的一种多因子、多基因参与的先天畸形疾病。Neurexin及Neuropgin蛋白分别为突出前跨膜吸附蛋白和突出后跨膜吸附蛋白,他们之间相互意义,相互连接,共同参与突触的构成,介导突触的连接。现在的探讨表明,在中枢神经体系中,Neurexin与Neuropgin的相互意义已经被证实可从推动中枢神经体系中突触的形成及支配突触的发生。而肠神经体系是一个在结构和功能上与中枢神经体系相似的复杂与独立的胃肠动力与感觉体系。肠神经体系的功能也是需要通过神经突触来实现,而先天性巨结肠的病因为典型的肠神经体系发育障碍造成狭窄段神经节细胞的缺失。由此通过探讨Neurexin与Neuropgin在先天性巨结肠不同肠段表量,进一步探索和分析先天性巨结肠神经节细胞却如的理由,可能为目前的探讨工作提供一种新的论述依据。Ghrepn(GHRL)是1999年被Kojmia等在大鼠胃中使用免疫组织化学办法发现的GHSR的内源性配体,是目前为止除生长激素释放激素和生长抑素外人们发现的第3个调节腺垂体生长激素分泌的内源性物质。Ghrepn是由28个氨基酸组成的活性肽,胃已被证明为合成和分泌Ghrepn的主要器官,同时其他消化器官如十二指肠、回肠、盲肠和结肠在表达Ghrepn的同时其浓度顺次逐渐减少另外在体内多种组织中广泛分布,胰、肾、肝、下丘脑、其余器官如淋巴组织,肾脏,肾上腺,心脏,垂体及丘脑下部,肿瘤组织等也有分泌也都表达Ghrepn.现在的探讨表明Ghrepn(GHRL)除了具有调节生长激素释放的意义外,应该具有更广泛的生物功能。Jeffery等的探讨证实,Ghrepn可从通过刺激癌细胞增殖而参与肿瘤的发生的,包括前列腺癌、肝细胞癌及大鼠垂体的生长激素瘤细胞.目前已经有探讨表明Ghrepn主要的生物学意义有从下几个方面1.推动多种激素释放(生长激素,催乳素,肾上腺素等)2.提升食欲,推动摄食,推动胃肠动力3.推动肿瘤细胞的增殖,抑制细胞凋亡。4.推动免疫细胞的增殖和分化5.刺激成骨细胞的增殖与分化等等。众所周知先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)患儿的病变理由是结肠远端神经节细胞的缺失,为典型的神经细胞发育障碍。其主要病因为患儿在胚胎发育历程中神经嵴细胞发育或者分化障碍所造成的神经发育停顿,肌间神经节细胞的缺失。目前对于先天性巨结肠(Hirschsprung's discase, HD)的病因探讨多是集中于神经干细胞本身发育历程中的某些基因转变或者是环境转变。但是究竟是什么理由导致的巨结肠病变部位的多种基因转变和肠道神经发育的环境缺陷?仍然有很漫长的路要走。我们前期的探讨已经证实(?)Neurexin及Neuropgin在动物和人的肠神经体系都有表达,并且已经证实Neurexin及Neuropgin分别为突触前和突触后跨膜蛋白,由此我们下一步需要探索Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠患儿不同的病变肠段的表达变化及临床作用。而且Kawamura等探讨表明在小鼠胚胎期Ghrepn mRNA就已经表达,并且贯穿胚胎发育的全历程,而且具有刺激多种细胞增殖和分化的功能.由此我们认为Ghrepn可能通过影响包括Neurexin及Neuropgi(?)基因在内的多种基因转变或胚胎发育环境转变,以而自胚胎时期就参与论文导读：
结肠神经干细胞的发育和分化历程,造成神经干细胞分化障碍,以而引起巨结肠疾病的发生。由此我们设计一系列的实验来研究这一不足。第一部分先天性巨结肠中Neurexin及Neuropgin蛋白在的表达变化及临床作用。实验目的：探讨Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠患儿不同肠段表达变化及临床作用。实验办法：1.选择2009年10月-2012年6月入住我院病房诊断为先天性巨结肠的患儿共20例(3月-2.5岁),男12例,女8例,均采取经肛门巨结肠根治术手术。术中切除病变肠段至近端正常肠管处(术中该处肠管病理示：查见正常神经节细胞)2.术后在切除肠段分出狭窄段、移行段及扩张段,分别取长约1cm肠段,PBS冲洗干净后放入EP管中剪碎加入细胞裂解液后进行Westernblot检测。因扩张段为正常肠管的继发性扩张,具有正常的神经节细胞,肠神经体系发育正常,由此多种文献报道,可从讲扩张段肠管作为正常对照组进行探讨。由此我们将扩张段肠管作为正常对照组来进行探讨.实验结果：先天性巨结肠患儿狭窄段几乎无Neurexin及Neuropgin蛋白表达,移行段表达量小于扩张段表达量。实验结论：Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠在各段的表达量,与神经节细胞的分布模式一致。呈正相关。说明Neurexin及Neuropgin作为突触前膜和突触后膜的跨膜蛋白,可能与肠神经体系神经节细胞发育历程中有关联,共同参与肠神经体系的发育和支配调节肠道运动的意义。第二部分先天性巨结肠中生长素Ghrepn表达的表达变化及临床作用I Ghrepn(GHRL)在先天性巨结肠患儿血清的表达及临床作用目的：探讨Ghrepn(GHRL)在在先天性巨结肠患儿及正常对照儿童血清的表达,并分析它们的表达状况同先天性巨结肠畸形之间的联系。办法：1选择2009年10月-2012年6月入住我院病房诊断为先天性巨结肠的患儿共40例,男22例,女18例,为探讨组；正常对照组儿童40例,男21例,女19例,为正常对照组。2.探讨组分别取术前1周内及术后1周内清晨空腹血3m1,同一时间取对照组清晨空腹血3ml,分别置于加入促凝管中,低温离心(3000r/min)10min后取上清液(血清)置于-70℃冰箱中待测Ghrepn。3. Ghrepn的测定采取意大利西亚克公司Apsei全自动酶标分析仪,ELISA办法进行测定,酶免试剂盒由美国Phoenix公司提供(SZK15ghrepn)。4.所有实验数据用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均值±标准差(x±s)表示,两组间对比采取t检验,多组间对比用方差分析。P0.05为差别有统计学作用结果：1.先天性巨结肠患儿年龄(7.40±1.28月)与正常对照年龄(7.45±0.98月)相比无统计学差别(P0.05)2.同样的年龄条件下,先天性巨结肠畸形患儿体重(7.25±0.38kg)和身高(63.724±1.97cm)较正常对照儿童体重(8.61±0.39kg)和身高(70.79±2.07cm)均略小,有统计学差别(P0.05),说明先天性巨结肠患儿较正常对照组儿童瘦小。3.同一时间段,术前1周内先天性巨结肠组血清中Ghrepn的水平(359.5±20.71ng/l)高于同一时间正常对照组血清中Ghrepn的水平(300.3±15.04ng/l)；术后1周内先天性巨结肠组血清中Ghrepn的水平(355.9±16.97ng/ml)高于同一时间正常对照组血清中Ghrepn的水平(298.8±15.34ng/ml),均有统计学差别(P0.05)。4.先天性巨结肠组内,术前1周内血清中Ghrepn的水平(359.5±20.71ng/l)与术后1周内血清中Ghrepn的水平(355.9±16.97ng/1),无显著统计学差别(P0.05)；正常对照组内,同巨结肠组术前1周内一时间血清中Ghrepn的水平(300.3±15.04ng/ml)与同巨结肠术后1周内同一时间血清中Ghrepn的水平(298.8±15.34ng/l)，无显著统计学差别(P0.05)结论：1.同样年龄条件下,先天性巨结肠患儿较正常对照组儿童瘦小,可能与其排便困难,营养吸收受限有关。2.先天性巨结肠患儿血清中Ghrepn水平术前1周内及术后1周内均高于正常对照儿童血清中G论文导读：放入EP管中剪碎加入细胞裂解液后进行Westemblot检测5.将Westernblot检测胶片扫描分析。将胶片图像通过QuantityOne-4.4.0软件进行图像分析,通过分别多次测定目的蛋白及Mark的平均光密度值,将图像资料转化为计数资料,进行统计6.所有实验数据用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均数±标准差s表示。对所得数据行方差分析和组间
hrepn水平.先天性巨结肠患儿组(及正常对照组)术前1周内和术后1周内血清中Ghrepn水平无显著变化,说明切除肠管未能转变血清Ghrepn的水平,结肠分布的Ghrepn的意义可能为局部意义。Ⅱ Ghrepn(GHRL)蛋白在先天性巨结肠中的表达及临床作用试验目的：探讨Ghrepn(GHRL)蛋白在先天性巨结肠患儿不同肠段中的表达及临床作用。试验办法：1.选择2009年10月-2012年6月入住我院病房诊断为先天性巨结肠的患儿共40例,男22例,女18例,病理资料完整。年龄3月-12月。手术均采取经肛门巨结肠根治术,术后病理报告证实,根治术切除的结肠近端肠壁均可检测到神经节细胞,狭窄段无神经节细胞,移行段肌问神经节细胞较扩张段显著减少。2.将手术后取出的标本分出狭窄段,移行段和扩张段一部分放置于甲醛中固定,甲醛液中固定好后将肠壁取出,梯度脱水,石蜡包埋,组织切片,厚度为4-5μm,先后经历脱蜡及水化,最后进行免疫组织化学染色(按说明说操作)。因扩张段具有正常的神经节细胞,肠神经体系发育正常,由此多种文献报道,可从讲扩张段肠管作为正常对照组进行探讨。由此我们将扩张段肠管作为正常对照组来进行探讨。3.在光学显微镜下,仔细观察免疫组化染色后的结果,通过显微图像采集体系,仔细观察各组切片免疫组化的表达状况,将每张切片放在相同倍数下(20×10)观察,然后随机采用6个不同视野的图像,图像分析采取软image-proplus5.0件进行,测定的数据为反应阳性部位的积分光密度值(integral optical density, IOD)。4.将手术后取出的标本在切除肠段中分出狭窄段、移行段及扩张段,分别取长约1cm肠段,PBS冲洗干净后放入EP管中剪碎加入细胞裂解液后进行Westemblot检测5.将Westernblot检测胶片扫描分析。将胶片图像通过Quantity One-4.4.0软件进行图像分析,通过分别多次测定目的蛋白及Mark的平均光密度值,将图像资料转化为计数资料,进行统计6.所有实验数据用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均数±标准差s表示。对所得数据行方差分析和组间两两对比,P0.05为差别有统计学作用。实验结果：1. GHRL蛋白主要分布于结肠的粘膜层内,染色为棕褐色(200倍光镜),核呈阴性。表达程度为狭窄段最少,移行段和扩张段逐渐增加。2. Westemblot检测显示GHRL蛋白表达以狭窄段至扩张段逐渐增加.3.使用图像分析软件对其免疫组化结果阳性染色面积平均光密度进行分析。狭窄段(0.188±0.009)、移行段(0.253±0.101)及扩张段(0.473±0.008)中GHRL的蛋白表达逐渐增加增加,具有统计学作用4. Westemblot检测胶片扫描分析显示GHRL蛋白表达以狭窄段至扩张段逐渐增加.具有统计学作用.实验结论：Ghrepn蛋白表达主要分布于结肠的粘膜层的腺管上皮细胞内及细胞间,在不同肠段表达有着差别,说明Ghrepn细胞在巨结肠不同肠段的分布不同,这种不同可能造成了局部环境的转变,以而导致了不同肠段的功能有着差别,内环境的转变有可能自胚胎时期导致了病变肠段神经节细胞在发育或分化历程障碍,最终导致先天性巨结肠的产生。Ⅲ Ghrepn(GHRL)蛋白对神经干细胞分化的影响试验目的：探讨Ghrepn(GHRL)蛋白极为拮抗剂在神经干细胞分化中的影响及临床作用。试验办法：1.神经干细胞的原代培养及传代：采取山东大学实验动物中心提供的孕12-14天SD大鼠,复合麻醉后,取出胚胎,取胎鼠的大脑皮层组织剪碎后处理成单细胞悬液,接种于未包被的细胞培养瓶中,加入无血清的神经干细胞培养基进行神经干细胞培养。神经干细胞球培养成功后进行传代,经过2-3代培养后将神经干细胞球进行鉴定和分化实验。2.神经干细胞的鉴定：将培养好的神经干细胞球打散成单个神经干细胞,接种于装有多聚赖氨酸包被玻片的5ml培养皿中,固定后进行神经干细胞特异性抗体Nestin免疫荧光检测。3. Ghrepn(GHRL)蛋白对神经干细胞分化状况的影响：将分散好的单个神经干细胞,从5×105/ml的浓度接种于装有多聚赖氨酸包被好的玻片的5ml培养皿中,液体量从能将神经干细胞铺到盖玻片上即可。将接种好的培养皿分成4组(A,B,C,D),分别加入除无论文导读：分化为神经元细胞的数量增多。关键词：先天性巨结肠论文Neurexin论文Neuropgin论文Ghrepn论文突触论文神经干细胞论文神经元细胞论文本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要7-15ABSTRACT15-24符号说明24-26第一
血清的神经干细胞培养基5ml外,分别加入(A)：10%胎牛血清；(B)10%胎牛血清,加Ghrepn (10-5mol/L);(C)10%胎牛血清,加Ghrepn特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6(10-5mol/L);(D)10%胎牛血清,加Ghrepn (10-5mol/L),加Ghrepn特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6(10-5mol/L)。4.将分组好的(A)(B)(C)(D)四组细胞培养48h后观察分化状况,并且给予固定后进行神经元细胞特异性抗体MAP免疫荧光检测。5.染色完成后,在荧光显微镜下,每个实验组分别随即选取5个高倍镜视野,计算阳性细胞个数,最终取平均值,通过SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均数±标准差s表示。对所得数据行组间两两对比,P0.05为差别有统计学作用。实验结果：1.神经干细胞通过Nestin染色显示,细胞核通过DAPI染色,神经元细胞通过MAP2染色。2.神经干细胞分化为神经元细胞历程中,加入Ghrepn组(B组)分化为神经元细胞的数量显著多于普通培养组(A组)、加Ghrepn特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6的组(C组)及加Ghrepn和特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6组(D组)；普通培养组(A组)、加入拮抗剂组(C组)及加Ghrepn和特异性受体拮抗剂组(D组)神经干细胞分化为神经元细胞的数量相似,无显著差别。实验结论：Ghrepn蛋白可从显著改进神经干细胞在分化历程中的内环境,减少神经干细胞的凋亡,使神经干细胞分化为神经元细胞的数量增多。关键词：先天性巨结肠论文Neurexin论文Neuropgin论文Ghrepn论文突触论文神经干细胞论文神经元细胞论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要7-15
ABSTRACT15-24
符号说明24-26
第一部分 Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠中的表达变化及临床作用26-51
前言26-30
实验材料和办法30-38
实验结果38-39
讨论39-43
结论43-44
参考文献44-51
第二部分 生长素Ghrepn先天性巨结肠中表达的表达变化及临床作用51-89
前言51-55
实验材料和办法55-73
实验结果73-76
讨论76-81
结论81-82
参考文献82-89
创新点及局限性89-90
附表及附图90-106
致谢106-107
博士在读期间发表的论文目录107-109
学位论文评阅及答辩状况表109-110
SCI文章Ⅰ110-126
SCI文章Ⅱ126-138
摘要：先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)又称结肠无神经节细胞症,是一种常见且严重的小儿先天性畸形,其发病率高达1/3000-1/5000,居小儿消化道畸形的第二位。其主要的病理变化为远端结肠肠壁内神经节细胞的缺如或功能异常,导致病变肠段持续性痉挛,成狭窄状态,粪便淤积于近端结肠,导致近端结肠代偿性肥厚、扩张。目前对先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)的病因探讨表明多种基因因素和环境因素共同意义而导致疾病的形成。探讨表明,多种基因参与调控肠壁内神经节细胞发育,目前已知的基因有RET基因,EDNRB基因与ED3基因,GDNF基因,Bcl-2基因等.这些基因的异常可能是HD发病的分子机制。与此同时,如细胞外基质,细胞粘附分子、缺氧和毒素、炎症等胚胎肠道神经发育的环境缺陷,也有可能参与了HD的发病。总之先天性巨结肠的病因是由遗传因素和环境因素共同参与意义,最终导致的一种多因子、多基因参与的先天畸形疾病。Neurexin及Neuropgin蛋白分别为突出前跨膜吸附蛋白和突出后跨膜吸附蛋白,他们之间相互意义,相互连接,共同参与突触的构成,介导突触的连接。现在的探讨表明,在中枢神经体系中,Neurexin与Neuropgin的相互意义已经被证实可从推动中枢神经体系中突触的形成及支配突触的发生。而肠神经体系是一个在结构和功能上与中枢神经体系相似的复杂与独立的胃肠动力与感觉体系。肠神经体系的功能也是需要通过神经突触来实现,而先天性巨结肠的病因为典型的肠神经体系发育障碍造成狭窄段神经节细胞的缺失。由此通过探讨Neurexin与Neuropgin在先天性巨结肠不同肠段表量,进一步探索和分析先天性巨结肠神经节细胞却如的理由,可能为目前的探讨工作提供一种新的论述依据。Ghrepn(GHRL)是1999年被Kojmia等在大鼠胃中使用免疫组织化学办法发现的GHSR的内源性配体,是目前为止除生长激素释放激素和生长抑素外人们发现的第3个调节腺垂体生长激素分泌的内源性物质。Ghrepn是由28个氨基酸组成的活性肽,胃已被证明为合成和分泌Ghrepn的主要器官,同时其他消化器官如十二指肠、回肠、盲肠和结肠在表达Ghrepn的同时其浓度顺次逐渐减少另外在体内多种组织中广泛分布,胰、肾、肝、下丘脑、其余器官如淋巴组织,肾脏,肾上腺,心脏,垂体及丘脑下部,肿瘤组织等也有分泌也都表达Ghrepn.现在的探讨表明Ghrepn(GHRL)除了具有调节生长激素释放的意义外,应该具有更广泛的生物功能。Jeffery等的探讨证实,Ghrepn可从通过刺激癌细胞增殖而参与肿瘤的发生的,包括前列腺癌、肝细胞癌及大鼠垂体的生长激素瘤细胞.目前已经有探讨表明Ghrepn主要的生物学意义有从下几个方面1.推动多种激素释放(生长激素,催乳素,肾上腺素等)2.提升食欲,推动摄食,推动胃肠动力3.推动肿瘤细胞的增殖,抑制细胞凋亡。4.推动免疫细胞的增殖和分化5.刺激成骨细胞的增殖与分化等等。众所周知先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)患儿的病变理由是结肠远端神经节细胞的缺失,为典型的神经细胞发育障碍。其主要病因为患儿在胚胎发育历程中神经嵴细胞发育或者分化障碍所造成的神经发育停顿,肌间神经节细胞的缺失。目前对于先天性巨结肠(Hirschsprung's discase, HD)的病因探讨多是集中于神经干细胞本身发育历程中的某些基因转变或者是环境转变。但是究竟是什么理由导致的巨结肠病变部位的多种基因转变和肠道神经发育的环境缺陷?仍然有很漫长的路要走。我们前期的探讨已经证实(?)Neurexin及Neuropgin在动物和人的肠神经体系都有表达,并且已经证实Neurexin及Neuropgin分别为突触前和突触后跨膜蛋白,由此我们下一步需要探索Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠患儿不同的病变肠段的表达变化及临床作用。而且Kawamura等探讨表明在小鼠胚胎期Ghrepn mRNA就已经表达,并且贯穿胚胎发育的全历程,而且具有刺激多种细胞增殖和分化的功能.由此我们认为Ghrepn可能通过影响包括Neurexin及Neuropgi(?)基因在内的多种基因转变或胚胎发育环境转变,以而自胚胎时期就参与论文导读：
结肠神经干细胞的发育和分化历程,造成神经干细胞分化障碍,以而引起巨结肠疾病的发生。由此我们设计一系列的实验来研究这一不足。第一部分先天性巨结肠中Neurexin及Neuropgin蛋白在的表达变化及临床作用。实验目的：探讨Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠患儿不同肠段表达变化及临床作用。实验办法：1.选择2009年10月-2012年6月入住我院病房诊断为先天性巨结肠的患儿共20例(3月-2.5岁),男12例,女8例,均采取经肛门巨结肠根治术手术。术中切除病变肠段至近端正常肠管处(术中该处肠管病理示：查见正常神经节细胞)2.术后在切除肠段分出狭窄段、移行段及扩张段,分别取长约1cm肠段,PBS冲洗干净后放入EP管中剪碎加入细胞裂解液后进行Westernblot检测。因扩张段为正常肠管的继发性扩张,具有正常的神经节细胞,肠神经体系发育正常,由此多种文献报道,可从讲扩张段肠管作为正常对照组进行探讨。由此我们将扩张段肠管作为正常对照组来进行探讨.实验结果：先天性巨结肠患儿狭窄段几乎无Neurexin及Neuropgin蛋白表达,移行段表达量小于扩张段表达量。实验结论：Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠在各段的表达量,与神经节细胞的分布模式一致。呈正相关。说明Neurexin及Neuropgin作为突触前膜和突触后膜的跨膜蛋白,可能与肠神经体系神经节细胞发育历程中有关联,共同参与肠神经体系的发育和支配调节肠道运动的意义。第二部分先天性巨结肠中生长素Ghrepn表达的表达变化及临床作用I Ghrepn(GHRL)在先天性巨结肠患儿血清的表达及临床作用目的：探讨Ghrepn(GHRL)在在先天性巨结肠患儿及正常对照儿童血清的表达,并分析它们的表达状况同先天性巨结肠畸形之间的联系。办法：1选择2009年10月-2012年6月入住我院病房诊断为先天性巨结肠的患儿共40例,男22例,女18例,为探讨组；正常对照组儿童40例,男21例,女19例,为正常对照组。2.探讨组分别取术前1周内及术后1周内清晨空腹血3m1,同一时间取对照组清晨空腹血3ml,分别置于加入促凝管中,低温离心(3000r/min)10min后取上清液(血清)置于-70℃冰箱中待测Ghrepn。3. Ghrepn的测定采取意大利西亚克公司Apsei全自动酶标分析仪,ELISA办法进行测定,酶免试剂盒由美国Phoenix公司提供(SZK15ghrepn)。4.所有实验数据用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均值±标准差(x±s)表示,两组间对比采取t检验,多组间对比用方差分析。P0.05为差别有统计学作用结果：1.先天性巨结肠患儿年龄(7.40±1.28月)与正常对照年龄(7.45±0.98月)相比无统计学差别(P0.05)2.同样的年龄条件下,先天性巨结肠畸形患儿体重(7.25±0.38kg)和身高(63.724±1.97cm)较正常对照儿童体重(8.61±0.39kg)和身高(70.79±2.07cm)均略小,有统计学差别(P0.05),说明先天性巨结肠患儿较正常对照组儿童瘦小。3.同一时间段,术前1周内先天性巨结肠组血清中Ghrepn的水平(359.5±20.71ng/l)高于同一时间正常对照组血清中Ghrepn的水平(300.3±15.04ng/l)；术后1周内先天性巨结肠组血清中Ghrepn的水平(355.9±16.97ng/ml)高于同一时间正常对照组血清中Ghrepn的水平(298.8±15.34ng/ml),均有统计学差别(P0.05)。4.先天性巨结肠组内,术前1周内血清中Ghrepn的水平(359.5±20.71ng/l)与术后1周内血清中Ghrepn的水平(355.9±16.97ng/1),无显著统计学差别(P0.05)；正常对照组内,同巨结肠组术前1周内一时间血清中Ghrepn的水平(300.3±15.04ng/ml)与同巨结肠术后1周内同一时间血清中Ghrepn的水平(298.8±15.34ng/l)，无显著统计学差别(P0.05)结论：1.同样年龄条件下,先天性巨结肠患儿较正常对照组儿童瘦小,可能与其排便困难,营养吸收受限有关。2.先天性巨结肠患儿血清中Ghrepn水平术前1周内及术后1周内均高于正常对照儿童血清中G论文导读：放入EP管中剪碎加入细胞裂解液后进行Westemblot检测5.将Westernblot检测胶片扫描分析。将胶片图像通过QuantityOne-4.4.0软件进行图像分析,通过分别多次测定目的蛋白及Mark的平均光密度值,将图像资料转化为计数资料,进行统计6.所有实验数据用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均数±标准差s表示。对所得数据行方差分析和组间
hrepn水平.先天性巨结肠患儿组(及正常对照组)术前1周内和术后1周内血清中Ghrepn水平无显著变化,说明切除肠管未能转变血清Ghrepn的水平,结肠分布的Ghrepn的意义可能为局部意义。Ⅱ Ghrepn(GHRL)蛋白在先天性巨结肠中的表达及临床作用试验目的：探讨Ghrepn(GHRL)蛋白在先天性巨结肠患儿不同肠段中的表达及临床作用。试验办法：1.选择2009年10月-2012年6月入住我院病房诊断为先天性巨结肠的患儿共40例,男22例,女18例,病理资料完整。年龄3月-12月。手术均采取经肛门巨结肠根治术,术后病理报告证实,根治术切除的结肠近端肠壁均可检测到神经节细胞,狭窄段无神经节细胞,移行段肌问神经节细胞较扩张段显著减少。2.将手术后取出的标本分出狭窄段,移行段和扩张段一部分放置于甲醛中固定,甲醛液中固定好后将肠壁取出,梯度脱水,石蜡包埋,组织切片,厚度为4-5μm,先后经历脱蜡及水化,最后进行免疫组织化学染色(按说明说操作)。因扩张段具有正常的神经节细胞,肠神经体系发育正常,由此多种文献报道,可从讲扩张段肠管作为正常对照组进行探讨。由此我们将扩张段肠管作为正常对照组来进行探讨。3.在光学显微镜下,仔细观察免疫组化染色后的结果,通过显微图像采集体系,仔细观察各组切片免疫组化的表达状况,将每张切片放在相同倍数下(20×10)观察,然后随机采用6个不同视野的图像,图像分析采取软image-proplus5.0件进行,测定的数据为反应阳性部位的积分光密度值(integral optical density, IOD)。4.将手术后取出的标本在切除肠段中分出狭窄段、移行段及扩张段,分别取长约1cm肠段,PBS冲洗干净后放入EP管中剪碎加入细胞裂解液后进行Westemblot检测5.将Westernblot检测胶片扫描分析。将胶片图像通过Quantity One-4.4.0软件进行图像分析,通过分别多次测定目的蛋白及Mark的平均光密度值,将图像资料转化为计数资料,进行统计6.所有实验数据用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均数±标准差s表示。对所得数据行方差分析和组间两两对比,P0.05为差别有统计学作用。实验结果：1. GHRL蛋白主要分布于结肠的粘膜层内,染色为棕褐色(200倍光镜),核呈阴性。表达程度为狭窄段最少,移行段和扩张段逐渐增加。2. Westemblot检测显示GHRL蛋白表达以狭窄段至扩张段逐渐增加.3.使用图像分析软件对其免疫组化结果阳性染色面积平均光密度进行分析。狭窄段(0.188±0.009)、移行段(0.253±0.101)及扩张段(0.473±0.008)中GHRL的蛋白表达逐渐增加增加,具有统计学作用4. Westemblot检测胶片扫描分析显示GHRL蛋白表达以狭窄段至扩张段逐渐增加.具有统计学作用.实验结论：Ghrepn蛋白表达主要分布于结肠的粘膜层的腺管上皮细胞内及细胞间,在不同肠段表达有着差别,说明Ghrepn细胞在巨结肠不同肠段的分布不同,这种不同可能造成了局部环境的转变,以而导致了不同肠段的功能有着差别,内环境的转变有可能自胚胎时期导致了病变肠段神经节细胞在发育或分化历程障碍,最终导致先天性巨结肠的产生。Ⅲ Ghrepn(GHRL)蛋白对神经干细胞分化的影响试验目的：探讨Ghrepn(GHRL)蛋白极为拮抗剂在神经干细胞分化中的影响及临床作用。试验办法：1.神经干细胞的原代培养及传代：采取山东大学实验动物中心提供的孕12-14天SD大鼠,复合麻醉后,取出胚胎,取胎鼠的大脑皮层组织剪碎后处理成单细胞悬液,接种于未包被的细胞培养瓶中,加入无血清的神经干细胞培养基进行神经干细胞培养。神经干细胞球培养成功后进行传代,经过2-3代培养后将神经干细胞球进行鉴定和分化实验。2.神经干细胞的鉴定：将培养好的神经干细胞球打散成单个神经干细胞,接种于装有多聚赖氨酸包被玻片的5ml培养皿中,固定后进行神经干细胞特异性抗体Nestin免疫荧光检测。3. Ghrepn(GHRL)蛋白对神经干细胞分化状况的影响：将分散好的单个神经干细胞,从5×105/ml的浓度接种于装有多聚赖氨酸包被好的玻片的5ml培养皿中,液体量从能将神经干细胞铺到盖玻片上即可。将接种好的培养皿分成4组(A,B,C,D),分别加入除无论文导读：分化为神经元细胞的数量增多。关键词：先天性巨结肠论文Neurexin论文Neuropgin论文Ghrepn论文突触论文神经干细胞论文神经元细胞论文本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要7-15ABSTRACT15-24符号说明24-26第一
血清的神经干细胞培养基5ml外,分别加入(A)：10%胎牛血清；(B)10%胎牛血清,加Ghrepn (10-5mol/L);(C)10%胎牛血清,加Ghrepn特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6(10-5mol/L);(D)10%胎牛血清,加Ghrepn (10-5mol/L),加Ghrepn特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6(10-5mol/L)。4.将分组好的(A)(B)(C)(D)四组细胞培养48h后观察分化状况,并且给予固定后进行神经元细胞特异性抗体MAP免疫荧光检测。5.染色完成后,在荧光显微镜下,每个实验组分别随即选取5个高倍镜视野,计算阳性细胞个数,最终取平均值,通过SPSS13.0软件进行统计学处理,结果用均数±标准差s表示。对所得数据行组间两两对比,P0.05为差别有统计学作用。实验结果：1.神经干细胞通过Nestin染色显示,细胞核通过DAPI染色,神经元细胞通过MAP2染色。2.神经干细胞分化为神经元细胞历程中,加入Ghrepn组(B组)分化为神经元细胞的数量显著多于普通培养组(A组)、加Ghrepn特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6的组(C组)及加Ghrepn和特异性受体拮抗剂[D-Lys3]-GHRP-6组(D组)；普通培养组(A组)、加入拮抗剂组(C组)及加Ghrepn和特异性受体拮抗剂组(D组)神经干细胞分化为神经元细胞的数量相似,无显著差别。实验结论：Ghrepn蛋白可从显著改进神经干细胞在分化历程中的内环境,减少神经干细胞的凋亡,使神经干细胞分化为神经元细胞的数量增多。关键词：先天性巨结肠论文Neurexin论文Neuropgin论文Ghrepn论文突触论文神经干细胞论文神经元细胞论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要7-15
ABSTRACT15-24
符号说明24-26
第一部分 Neurexin及Neuropgin蛋白在先天性巨结肠中的表达变化及临床作用26-51
前言26-30
实验材料和办法30-38
实验结果38-39
讨论39-43
结论43-44
参考文献44-51
第二部分 生长素Ghrepn先天性巨结肠中表达的表达变化及临床作用51-89
前言51-55
实验材料和办法55-73
实验结果73-76
讨论76-81
结论81-82
参考文献82-89
创新点及局限性89-90
附表及附图90-106
致谢106-107
博士在读期间发表的论文目录107-109
学位论文评阅及答辩状况表109-110
SCI文章Ⅰ110-126
SCI文章Ⅱ126-138