试述靶向功能化金纳米颗粒合成、表征及其与蛋白质和细胞相互作用

论文导读：会吸附蛋白质,形成蛋白质冠状物,SDS-PAGE分离吸附到纳米颗粒上的蛋白质,发现所有纳米颗粒的表面都结合了一定量的蛋白质,除GNP01外,其它纳米颗粒结合蛋白质的量,以SDS-PAGE上看不出显著差别,用LC/MS/MS鉴定结合到纳米颗粒上蛋白质的种类,发现纳米颗粒结合的蛋白质种类在60种左右,且有30种左右的蛋白质都能结合到所鉴定的四种
摘要：纳米材料具有潜在医学价值,可从用于载药、载基因等,作为治疗试剂,也可从作为造影剂,用于诊断疾病,纳米颗粒自身的几点性质也能杀死细胞,如光热效应等。同时,纳米材料也在电子学、光学、催化等领域有很多用途,由于纳米材料的广泛运用,人们逐渐开始关注纳米材料对人体的危害,亟需体系的评价纳米材料在体内的分布、代谢、排泄、从及累积造成的器官损伤等,现已形成一个新的探讨领域,纳米毒理学。不论是纳米医学,还是纳米毒理学,都离不开了解最基本的纳米颗粒与蛋白质和细胞的相互意义,纳米材料所有的生物学效应,以蛋白质吸附,转变蛋白质构象,到特异性的细胞结合与内吞,杀死病变细胞,再到肝脾累积、氧化损伤,都是基于纳米颗粒与蛋白质和细胞的相互意义,所从有必要探讨这种相互意义,一方面可从指导设计构建安全有效的纳米载体,另一方面可从制约并减少纳米材料造成的人体危害。通常,纳米材料失控的细胞毒性,如造成的细胞功能紊乱、细胞周期阻滞、甚至让细胞凋亡坏死,都是由于纳米材料与细胞的非特异性相互意义造成的,这些非特异性的意义,包括静电意义、疏水意义、氢键意义、空间效应、π键堆积等,其中静电意义是非常重要的一种意义力,目前很多探讨纳米材料与细胞的静电意义仅局限于选择三种代表性的纳米材料：带正电的、中性的和带负电的纳米材料,而没有考虑表面电荷密度的影响,也没有考虑其它非特异性意义的干扰。为了探讨不同表面电荷密度的纳米材料与细胞的静电意义和尽量减少其它非特异性意义的干扰,通过调节结构基本一致的带电配体和中性配体的比例,我们合成了一个表面电荷密度连续变化的金纳米颗粒阵列,这个阵列共17种纳米材料,尺寸为5nm左右的园形纳米颗粒,用元素分析法和碘切后HPLC/MS/CLND分析法定量纳米颗粒表面的各种配体的数目,依此计算出阵列的表面电荷密度,如果把100%覆盖单电荷配体的纳米颗粒的表面电荷定义为1.0,此阵列的表面电荷密度变化范围为：+2.87到-4.18。用此阵列在25和50μg/mL两种浓度下,与细胞孵育12hrs后,细胞的摄取量和表面电荷密度之间并没有线性联系,负电荷和中性的纳米颗粒几乎没有细胞摄取,在GNP05(表面电荷密度+0.52)处,有一个拐点,细胞摄取量开始大量增多,GNP01到GNP04(表面电荷密度以+287到+1.0)细胞摄取量都在最大处,没有明显性差异。可能是由于掩蔽等理由,只有暴露在最外层的表面电荷才能与细胞发生静电意义,表面正电荷密度进一步增多,也不会增多纳米颗粒的摄取量,这些细胞摄取纳米颗粒的差别,进一步用时间依赖的细胞摄取、摄取纳米颗粒细胞的TEM照片和摄取纳米颗粒细胞的暗场显微镜照片进行验证。测量纳米颗粒在水中的Zeta电位,发现在GNP09(中性纳米颗粒)处,有一个Zeta电位以正到负的改变,这种变化走势类似于细胞摄取量的变化走势,Zeta电位更能反映纳米颗粒在溶液中真实的静电性质。当纳米颗粒分散在含血清细胞培养基中,其表面会吸附蛋白质,形成蛋白质冠状物,SDS-PAGE分离吸附到纳米颗粒上的蛋白质,发现所有纳米颗粒的表面都结合了一定量的蛋白质,除GNP01外,其它纳米颗粒结合蛋白质的量,以SDS-PAGE上看不出显著差别,用LC/MS/MS鉴定结合到纳米颗粒上蛋白质的种类,发现纳米颗粒结合的蛋白质种类在60种左右,且有30种左右的蛋白质都能结合到所鉴定的四种纳米颗粒上。测量吸附蛋白质纳米颗粒的Zeta电位发现,吸附的蛋白质使阵列里所有纳米颗粒在溶液里的Zeta电位都是负的,且没有差别,但是吸附蛋白质纳米颗粒的细胞摄取是差别,可能吸附蛋白质在纳米颗粒表面有一个结合与解离的动态历程,并不能决定纳米颗粒与细胞的静电意义。我们发现,纳米颗粒的表面电荷密度,纳米颗粒的Zeta电位,和吸附蛋白质纳米颗粒的Zeta电位,这三种描述纳米材料带电性质的参数,都不符合纳米材料带电性质与细胞摄取的联系,如果把纳米颗粒最外层的表面电荷密度定义为有效表血电荷密度,有效表面电荷密度可从解释正电荷的密度过高后,细胞摄取量会不再增多,所从说有效表面电荷密度决定了纳米颗粒与细胞的静电意义。同时,虽然正电荷纳米颗粒能大量被细胞摄取,前提条件是其表面的正电荷密度需要达到一定量,从提供足够大的静电意义力,引发细胞的内吞行为。蛋白质吸附能让正电荷纳米颗粒的表面电性变成负的,但纳米颗粒表面的论文导读：
正电荷基团仍能暴露出来并吸附到细胞表面。纳米颗粒用于载药时,为了增强特异性,提升药效,通常会在纳米颗粒表面修饰抗体或其它靶向分子,这些靶向分子能与病变细胞表面特有的受体或过表达的受体特异性的结合,以而只进入并杀死病变组织或细胞,不会产生副意义。但是,当纳米颗粒进入到血液等生理环境中,其表面会吸附蛋白质等生物大分子,形成蛋白质冠状物,这种蛋白质冠状物会影响纳米颗粒与细胞的相互意义。目前,关于这种蛋白质吸附是否会影响纳米颗粒靶向性的探讨仍很少,人们在设计靶向性纳米颗粒时,也很少会考虑蛋白质吸附的影响,为了探讨吸附蛋白质对纳米颗粒靶向性的影响,我们合成了三种尺寸的靶向性金纳米颗粒,根据纳米颗粒的TEM照片,统计的粒径分别是GNP-5:45±2.5nm,GNP-15:14.2±1.6nm,GNP-40:38.8±49nm。SDS-PAGE显示纳米颗粒分散在含血清的细胞培养基中,其表面将吸附蛋白质。吸附蛋白质的靶向性纳米颗粒和靶向性纳米颗粒自身相比,细胞摄取量有差别,这些差别与纳米颗粒的尺寸、剂量从及靶向受体的密度有关。小粒径的纳米颗粒,曲率大,靶向分子与细胞表面受体间不易发生多键意义,吸附的蛋白质易阻碍靶向分子与受体的结合,以而使其摄取量下降较多。大粒径的纳米颗粒,曲率小,由于靶向分子与细胞表面受体间有着多键意义,吸附的蛋白质不能完全阻碍靶向分子与受体的结合,同时吸附的蛋白质也会与细胞表面受体间有着多键意义,提供了额外的意义力,使大粒径纳米颗粒的细胞摄取量略微增多。中等尺寸的纳米颗粒,在高剂量时,体现为摄取的阻碍,在低剂量时,体现为摄取的增多,可能是由于中等尺寸纳米颗粒的靶向分子与细胞表面受体间有着多种意义模式,低剂量时,能与靶向分子结合的受体没有饱和,会发生多键意义；高剂量时,受体结合达到饱和,发生多键意义的概率降低。降低可结合靶向受体的密度后,小粒径纳米颗粒的细胞摄取量,在蛋白质吸附前后,差别变小甚至无差别,这是因为此时,所有纳米颗粒都不易与受体结合,都不易被细胞摄取,以而让摄取量差别变小。而结合蛋白质的大粒径纳米颗粒的细胞摄取量始终多于纳米颗粒自身,因为大粒径纳米颗粒结合的蛋白质能与细胞表面发生多种蛋白质结合的多键意义,以而增多其细胞摄取量。基于从上探讨,我们认为吸附蛋白质对纳米材料的靶向性是有影响的,由此在设计靶向纳米载体时,不仅需要考虑载体的尺寸,而且要考虑临床所用剂量和靶向受体的密度。关键词：金纳米颗粒论文表面电荷密度论文蛋白质吸附论文细胞摄取论文靶向性论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。摘要12-16
ABSTRACT16-20
符号说明20-22
第一章 绪论22-60

1.1 引言22-24

1.2 金纳米颗粒合成、表征、功能化、医学运用极为毒性24-31

1.2.1 金纳米颗粒的合成24-25

1.2.1 Brust-Schiffrin法24-25

1.2.2 柠檬酸还原法25

1.2.3 晶体生长法25

1.2.2 金纳米颗粒的表征25-28

1.2.2.1 金核的表征办法25-26

1.2.2.2 金纳米颗粒表面配体的定性表征办法26-27

1.2.2.3 金纳米颗粒表面配体的定量分析办法27-28

1.2.3 金纳米颗粒的功能化修饰28-29

1.2.4 功能化金纳米颗粒的医学运用29-30

1.2.5 金纳米颗粒的毒性30-31

1.3 纳米材料与蛋白质的相互意义31-38

1.3.1 探讨蛋白质冠状物的办法31-33

1.3.2 纳米材料吸附蛋白质的机制33-34

1.3.3 蛋白质冠状物的组成和结构34-36

1.3.4 合成属性对蛋白质冠状物的影响36-37

1.3.5 生物属性对生理反应的影响37-38

1.4 纳米材料与细胞的相互意义38-43

1.4.1 内吞(Endocytosis)纳米材料的机制38-40

1.4.2 探讨纳米材料内吞机制的办法40-41

1.4.2.1 药理学抑制剂40-41

1.4.2.2 细胞表达突变蛋白质和小干扰RNA的利用41

1.4.3 细胞内纳米颗粒的定位41-42

1.4.4 摄入的纳米材料对细胞生理历程的影响42

1.4.5 细胞论文导读：2硫辛酰胺丙胺的合成642.3.1金纳米颗粒阵列的合成64-662.3.2电子显微镜观察金纳米颗粒形貌662.3.3动态水合粒径测量662.3.4Zeta电位测量66-672.3.4.1水中金纳米颗粒的Zeta电位测量662.3.4.2水中结合蛋白质的金纳米颗粒的Zeta电位测量66-672.3.5碘切后用HPLC/MS/CLND)定量配体672.3.6用元素分析法定量配体67-682
排出与降解纳米材料42-43

1.5 本探讨工作的作用与前景43-44

1.6 参考文献44-60

第二章 有效表面电荷密度决定纳米材料与细胞的静电意义60-91

2.1 引言60-61

2.2 实验材料与仪器61-63

2.1 实验材料61-62

2.2 实验仪器62-63

2.3 实验办法63-71

2.3.0 配体3疏辛酰胺丙胺的合成63-64

2.3.0.1 Boc单端保护丙二胺的合成63-64

2.3.0.2 硫辛酰胺丙胺的合成64

2.3.1 金纳米颗粒阵列的合成64-66

2.3.2 电子显微镜观察金纳米颗粒形貌66

2.3.3 动态水合粒径测量66

2.3.4 Zeta电位测量66-67

2.3.4.1 水中金纳米颗粒的Zeta电位测量66

2.3.4.2 水中结合蛋白质的金纳米颗粒的Zeta电位测量66-67

2.3.5 碘切后用HPLC/MS/CLND)定量配体67

2.3.6 用元素分析法定量配体67-68

2.3.7 细胞培养68

2.3.8 金纳米颗粒的细胞摄取68

2.3.8.1 不同金纳米颗粒浓度的细胞摄取68

2.3.8.2 不同时间点金纳米颗粒的细胞摄取68

2.3.9 ICP-MS定量细胞内金纳米颗粒68-69

2.3.10 暗场显微镜细胞成像69

2.3.11 透射电子显微镜细胞成像69-70

2.3.12 SDS-PAGE法分离纳米颗粒吸附的蛋白质70

2.3.13 用LC/MS/MS法鉴定结合蛋白质种类70-71

2.3.14 细胞毒性测量71

2.4 结果与讨论71-84

2.4.1 合成表面电荷密度连续变化的金纳米颗粒阵列71-74

2.4.2 阵列表面电荷密度的表征74-79

2.4.3 表面电荷密度与细胞摄取量的联系79-82

2.4.4 有效表面电荷密度决定了纳米材料与细胞的静电意义82-83

2.4.5 蛋白质冠状物对纳米材料与细胞的静电意义的影响83-84

2.5 结论84-85

2.6 参考文献85-91

第三章 蛋白质吸附对纳米材料靶向性的影响91-121

3.1 引言91-92

3.2 实验材料与仪器92-94

3.

2.1 实验材料92-93

3.

2.2 实验仪器93-94

3.3 实验办法94-101

3.1 金纳米颗粒的合成94-95

3.2 金纳米颗粒的功能化95-96

3.3 用UV-Vis吸光光度法定量金纳米颗粒配体的上载量96

3.4 TEM观察金纳米颗粒形貌96

3.5 动态水合粒径测量96

3.6 Zeta电位测量96-97

3.7 凝胶电泳97

3.8 细胞培养及纳米颗粒的细胞摄取97-98

3.9 ICP-MS测定细胞内金含量98

3.10 紧密结合冠状物对细胞识别的影响98-99

3.11 自由叶酸有着下的竞争细胞摄取实验99

3.12 用抑制剂探讨细胞摄取机制99-100

3.13 透射电子显微镜细胞成像100

3.14 细胞毒性测量100-101

3.4 结果与讨论101-117

3.4.1 靶向性金纳米颗粒的合成与表征101-104

3.4.2 纳米颗粒的蛋白质吸附104-105

3.4.3 纳米颗粒没有细胞毒性105-107

3.4.4 靶向性纳米颗粒能结合到细胞膜上并主要分布在细胞内吞体/溶酶体内107

3.4.5 蛋白质吸附阻碍小粒径纳米颗粒的细胞识别107-109

3.4.6 蛋白质吸附略微增强大粒径纳米颗粒的细胞识别109-111

3.4.7 蛋白质吸附对中等粒径纳米颗粒细胞识别的影响是剂量依赖的111-113

3.4.8 紧密冠状物不影响纳米颗粒的细胞识别113-114

3.4.9 吸附的蛋白质能增强纳米颗粒与细胞的结合114-115

3.4.10 吸附蛋白质对内吞路径的影响115-117

3.5 结论117

3.6 参考文献117-121

第四章 总结与展望121-124

4.1 总结121-122

4.2 展望122-124

附录124-131
致谢131-132
攻读博士期间发表的学术论文目录132-134
学位论文评阅及答辩状况表134