浅论添加剂重组毕赤酵母表达米根霉（Rhizopusoryzae）脂肪酶发酵调控及酶稳定性

论文导读：探讨发展141.3课题探讨思路和内容14-15第二章材料与办法15-232.1菌种152.2培养基152.3主要试剂与仪器15-162.4实验办法16-232.

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摘要：近几十年来，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已逐渐成为一种运用最为广泛的表达体系，受到学者们的广泛关注。这主要是因为它不仅是一种真核表达体系，其所包涵的强启动子醇氧化酶1(AOX1)可从促使菌体较快生长、达到较高的外源蛋白表达量，而且还因为其所利用的无机盐培养基成本低，外源蛋白可分泌的特征，使得大规模的产业化生产更易实现。为了获得更高水平的米根霉脂肪酶表达量，本论文主要探讨了共表达伴侣蛋白、脂肪酶的基因拷贝数从及碳氮源对米根霉脂肪酶表达的影响，同时进行了酶稳定性的探讨。主要的探讨内容包括：（1）实验对比了添加共表达伴侣蛋白（蛋白质二硫键异构酶PDI和内质网氧化还原1蛋白Ero1p的基因）对米根霉脂肪酶在巴斯德毕赤酵母中发酵产酶的影响。实验表明，共表达伴侣蛋白菌株BH128发酵产酶能力高于非共表达伴侣蛋白菌株H238，最高脂肪酶活力可达到7016.1U/mL，最大总产物比形成速率达到827.1U/(gDCW·h)，分别是H238的1.7和2.7倍；同时，在实验中发现，添加共表达伴侣蛋白使得发酵周期缩短了20h。（2）实验对比了两株不同基因拷贝数的共表达伴侣蛋白菌株对发酵产脂肪酶的影响。实验表明，2拷贝的BH128发酵整体水平高于7拷贝的BH127。其中，BH128的单位菌体酶活为46310.2U/gDCW，高于BH127，而且对底物和氧气的消耗仅为BH127的0.7和0.5倍。同时，在实验中发现高拷贝数的菌株对后期菌体产酶的负荷从及成本的消耗都有很大的影响。（3）实验对比了不同NH_4~+浓度对菌体表达外源蛋白的影响。实验表明，当维持NH_4~+浓度在8g/L时，米根霉脂肪酶酶活最高，可达到12019.0U/mL，分别是空白、补加并维持NH_4~+浓度在7g/L、9g/L条件下的1.7、1.1、1.4倍；其总蛋白浓度最高可达9.9g/L，分别是后三者的1.4、1.1、1.3倍；同时，在实验中发现，补加(NH_4)_2SO_4溶液后的三者在蛋白酶含量、产物比形成速率、底物比消耗速率、AOX酶活性和ATP能量物质方面上都优于空白条件。（4）实验对比了不同比例的甘油-甲醇双碳源流加对菌体表达外源蛋白的影响。实验表明，当甘油-甲醇比例为1.0:9.0时，米根霉脂肪酶酶活最高，可达到13349.3U/mL，分别是单一甲醇碳源（后面均从空白表示）、0.5:9.5、1.5:8.5条件下的1.11、1.08、1.34倍；其总蛋白浓度最高可达10.1g/L；同时，在实验中发现，当甘油所占比例达到15%（1.5:8.5）时，会阻遏菌体对甲醇的使用，不利于外源蛋白的高效表达；但是当甘油比例较适中（1.0:9.0）时，这种阻遏现象并不显著，反而会推动菌体的生长与外源蛋白的表达。（5）实验对比了不同小分子添加剂对液体和固体米根霉脂肪酶在4C、25C和37C条件下的稳定性影响。实验表明，液体酶在这三个温度条件下的最佳添加剂分别是4%的山梨醇、4%的山梨醇和25%的甘油，半衰期分别是167.7d、109.9d和60.3d；固体酶在这三个温度条件下的最佳添加剂分别是3%的淀粉、3%的淀粉和3%的糊精，半衰期分别是449.5d、374.9d和337.3d。关键词：米根霉脂肪酶论文共表达伴侣蛋白论文基因拷贝数论文氮源论文小分子添加剂论文
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Abstract5-7
目录7-9
第一章 绪论9-15

1.1 立题作用9-10

1.2 国内外探讨发展10-14

1.2.1 根霉脂肪酶介绍10-11

1.2.2 外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及所出现的关键不足11-12

1.2.3 共表达伴侣蛋白对外源蛋白表达的影响12

1.2.4 基因拷贝数对外源蛋白表达的影响12-13

1.2.5 氮源对外源蛋白表达的影响13

1.2.6 碳源对外源蛋白表达的影响13-14

1.2.7 酶的稳定性探讨发展14

1.3 课题探讨思路和内容14-15

第二章 材料与办法15-23

2.1 菌种15

2.2 培养基15

2.3 主要试剂与仪器15-16

2.4 实验办法16-23

2.

4.论文导读：

1 培养办法16-17

2.4.2 甲醇浓度检测17

2.4.3 生物量测定17

2.4.4 脂肪酶水解活力的测定17-18

2.4.5 总蛋白含量的测定18

2.4.6 蛋白酶活力测定18

2.4.7 游离氨离子浓度的测定18-19

2.4.8 ATP 能量物质测定19-20

2.4.9 醇氧化酶、甲醛脱氢酶、甲酸脱氢酶的活性测定20-21

2.4.10 表达产物 SDS-PAGE 分析21

2.4.11 半衰期 t1/2 的测定21-22

2.4.12 相对酶活的测定22

2.4.13 固体酶粉的制备22-23

第三章 结果与讨论23-48

3.1 巴斯德毕赤酵母共表达伴侣蛋白对米根霉脂肪酶表达的影响23-28

3.

1.1 巴斯德毕赤酵母共表达伴侣蛋白对产酶和菌体生长的影响23-25

3.

1.2 巴斯德毕赤酵母共表达伴侣蛋白对发酵历程的影响分析25-26

3.

1.3 巴斯德毕赤酵母共表达伴侣蛋白影响外源蛋白表达的机理分析26-28

3.2 拷贝数对米根霉脂肪酶表达的影响28-32
3.

2.1 拷贝数对产酶和细胞生长的影响28-30

3.

2.2 拷贝数对发酵历程的影响分析30-32

3.3 氮源对米根霉脂肪酶表达的影响32-37

3.1 氮源对产酶和菌体生长的影响32-34

3.2 氮源对发酵历程的影响分析34-36

3.3 氮源对胞内关键酶活性的影响与分析36-37

3.4 碳源对米根霉脂肪酶表达的影响37-41

3.4.1 碳源对产酶和菌体生长的影响37-39

3.4.2 碳源对发酵历程的影响分析39-40

3.4.3 碳源对胞内关键酶活性的影响与分析40-41

3.5 小分子添加剂对米根霉脂肪酶酶稳定性的影响41-48

3.5.1 液体酶稳定性探讨41-44

3.5.2 固体酶稳定性探讨44-48

主要结论及展望48-50
致谢50-51
参考文献51-55
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文55