探索糖苷酶β-葡萄糖苷酶分泌表达型乙醇发酵E.coli工程菌构建

论文导读：
摘要：随着化石燃料的日益匮乏和环境的严峻恶化,使用微生物将可再生资源转化为清洁能源越来越受重视,而其中燃料乙醇因其优越的性能,有望在未来替代石油作为能源,而纤维素乙醇产业的经济性是产业化的关键。本论文探讨构建能够分泌表达纤维素酶的产乙醇菌株,实现降解木质纤维素生产乙醇的整合生物加工历程。文中通过克隆来自运动发酵单胞菌Zymomonas mobips ZM4的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB,并通过Red重组将二者整合到大肠杆菌Escherichia cop JM109基因组中,首先构建了一株可从使用葡萄糖进行乙醇发酵的重组菌E. cop P81。随后将来源于多粘芽胞杆菌Bacillus polymyxa1.794的β-葡萄糖苷酶基因bglB在E.cop P81中进行了分泌表达,得到了一株可从进行纤维二糖降解和乙醇发酵双重功能的重组菌E.cop P81(pUC19-bglB)。该菌胞外分泌β-糖苷酶活达到84.78mU/mL菌液,纤维二糖酶活达到了32.32mU/mL菌液。该重组菌E.cop P81(pUC19-bglB)从纤维二糖为碳源进行乙醇发酵,乙醇得率达到了论述产率55.8%,而在葡萄糖和纤维二糖的共发酵中,其乙醇产量达到了论述产率46.5%。构建得到的此株CBP大肠杆菌能够使用p-葡萄糖苷酶生产乙醇,为构建能使用木质纤维素分解产物生产燃料乙醇的高效、稳定生产用工程菌奠定了良好的基础。关键词：大肠杆菌论文乙醇发酵论文β-葡萄糖苷酶论文分泌表达论文CBP论文
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Abstract6-9
前言9-10
第1章 文献综述10-23

1.1 生物乙醇概述10-11

1.1 开发生物乙醇的作用10-11

1.2 生物乙醇的历史和近况11

1.2 木质纤维素11-14

1.2.1 木质纤维素的概述11-12

1.2.2 木质纤维素的组成12-14

1.3 β-葡萄糖苷酶概述14-15

1.3.1 β-葡萄糖苷酶的分类14-15

1.3.2 β-葡萄糖苷酶的性质15

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定办法15

1.4 木质纤维质的使用15-19

1.4.1 木质纤维素的代谢工艺15-16

1.4.2 整合生物加工工艺16-17

1.4.3 常见的CBP构建菌17-19

1.5 常见的乙醇路径19-21

1.6 课题探讨的作用与内容21-23

第2章 材料与办法23-36

2.1 实验材料23-26

2.

1.1 菌株与载体23-24

2.

1.2 主要试剂24

2.

1.3 实验仪器24-25

2.

1.4 培养基和主要溶液的配制25-26

2.2 实验及分析办法26-36

2.1 基因组DNA的提取26-27

2.2 基因pdc、adhB的PCR扩增27-28

2.3 Overlap PCR添加启动子P_(tac)28-29

2.4 pdc、adhB和bglB表达体系的构建29-30

2.5 基因pdc和adhB的定性检测30-31

2.6 Red重组整合乙醇路径31-33

2.7 蛋白浓度的测定和SDS-PAGE电泳33

2.8 重组菌的酶活测定33-35

2.9 重组菌发酵纤维二糖的条件35-36

第3章 代谢纤维二糖产乙醇CBP工程菌的构建36-49

3.1 乙醇路径的构建36-39

3.

1.1 基因pdc-adhB的克隆36-37

3.

1.2 乙醛指示平板定性检测酶活37-38

3.

1.3 pdc和adhB的蛋白质表达38-39

3.2 Red重组整合乙醇生产路径39-41
3.

2.1 Red重组相关质粒的构建39-40

3.

2.2 整合乙醇路径40-41

3.3 重组菌E. cop P81(pUC19-bglB)的构建41

3.4 重组菌E. cop P81(pUC19-bglB)的酶活测定41-43

3.4.1 乙醛指示平板定性检验41-42

3.4.2 重组菌E. cop P81(pUC19-bglB)的AdhB酶活测定42

3.4.3 重组菌中BglB酶活测定42-43

3.5 纤维二糖为碳源的乙醇发酵43-49

3.5.1 重组菌E. cop P81论文导读：(pUC19-bglB)从纤维二糖为唯一碳源的发酵43-443.5.2重组菌E.copP81(pUC19-bglB)发酵纤维二糖生产乙醇44-463.5.3纤维二糖的浓度对重组菌E.copP81(pUC19-bglB)发酵的影响46-473.5.4葡萄糖对重组菌E.copP81(pUC19-bglB)代谢纤维二糖的影响47-49第4章结论与展望49-51参考文献51-57致谢57上一页12
(pUC19-bglB)从纤维二糖为唯一碳源的发酵43-44
3.5.2 重组菌E. cop P81(pUC19-bglB)发酵纤维二糖生产乙醇44-46
3.5.3 纤维二糖的浓度对重组菌E. cop P81(pUC19-bglB)发酵的影响46-47
3.5.4 葡萄糖对重组菌E. cop P81(pUC19-bglB)代谢纤维二糖的影响47-49
第4章 结论与展望49-51
参考文献51-57
致谢57