试议大肠杆菌运用液相蛋白芯片技术检测食源性大肠杆菌0157：H7设计

论文导读：mL（増菌前）。（4）运用建立办法检测154份实际牛肉样品，检出阳性样品19份，细菌培养法检测，检出阳性样品16份。（5）对比分别从DMAC与H_2O作EDC、NHS溶解剂的检测灵敏低，DMAC为溶解剂可检出阳性的最低浓度为10~3cfu/mL（増菌后），LOD为100cfu/mL；H_2O为溶解剂可检出阳性的最低浓度为104cfu/mL（増菌后），LOD为10~3cfu/mL.（6）分别从DMAC
摘要：本探讨建立了大肠杆菌O157:H7（E.cop O157:H7）液相蛋白芯片检测办法，初步探究了N,N-二乙酰胺（DMAC）作为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的溶解剂进行微球激活对提升微球耦连效率及检测灵敏度的意义，并运用建立办法对154份实际牛肉样品进行检测。本论文具体探讨内容如下：1.分离培养E.cop O157：H7标准菌株，经甲醛灭活、超声破碎获得灭活抗原，弗氏佐剂乳化法制备疫苗，免疫Balb/C小鼠，腹水法制备针对E.copO157：H7致病菌的特异性单克隆抗体并进行单抗特性的评价。（1）制备了两株稳定分泌E.cop O157:H7单抗的杂交瘤细胞株，染色体数目为90，证明融合成功，具有稳定遗传性。（2）对两株单抗特性做了较全面鉴定。结果证明所获得单抗为IgG型；效价为1:512000和1:1024000；抗体蛋白含量为18.459mg/mL和23.014mg/mL；单抗对18种肠道菌特异性良好；亲和常数为1.01×10~8，为高亲和力抗体；SDS-PAGE条带清晰，杂带少，证明单抗纯度较高；一个月、三个月、六个月后单抗效价无变化，证明单抗稳定性良好。2.制备疫苗免疫新西兰大耳兔，心脏无菌取血，分离纯化制备针对E.copO157:H7致病菌的多克隆抗体，运用生物素标记试剂盒进行生物素化，计算生物素标记水平。（1）抗体效价为1:64000；与18种肠道菌反应阴性，特异性良好；纯化后蛋白含量44.18mg/mL。（2）最佳多抗纯化条件为35%、100%洗脱液两步洗脱。（3）制备生物素标记多抗，每分子蛋白可标记3分子生物素，适合运用于下一步继续实验。3.探索运用DMAC作为EDC、NHS溶解剂对提升耦连效率的意义。（1）微球与单抗耦连成功，是E.cop O157：H7液相芯片的检测成功建立的基础。（2）分别运用DMAC与H_2O溶解EDC、NHS激活微球进行单抗耦连，测得荧光强度中位数（MFI）分别为3012和2253，即DMAC可显著提升微球与蛋白耦连效率。（3）每次检测（2μL微球）最佳蛋白耦连量为95μg。4.建立了检测E.cop O157：H7的液相蛋白芯片办法。绘制检测曲线，评价该检测办法特异性、灵敏性、重复性。分别运用该办法及H_2O作溶解剂的液相芯片办法检测实际牛肉样品，对比该办法与细菌分离培养法阳性检出率及探索DMAC对阳性检出率的影响。（1）优化检测实验条件，得到最佳生物素标记多抗添加量为76μg；最佳SA-PE添加量为0.5μg；SA-PE最佳反应时间为30min。（2）运用各项最佳反应条件，建立检测办法。建立办法能检出阳性的最低浓度为10~3cfu/mL（増菌后），LOD为100cfu/mL；与18种肠道菌无交叉反应，特异性良好；三次重复实验，批间变异系数7.61，重复性良好。（3）运用建立办法检测牛肉样品中人工添加细菌，能检出阳性的最低浓度为0.5cfu/mL（増菌前）。（4）运用建立办法检测154份实际牛肉样品，检出阳性样品19份，细菌培养法检测，检出阳性样品16份。（5）对比分别从DMAC与H_2O作EDC、NHS溶解剂的检测灵敏低，DMAC为溶解剂可检出阳性的最低浓度为10~3cfu/mL（増菌后），LOD为100cfu/mL；H_2O为溶解剂可检出阳性的最低浓度为104cfu/mL（増菌后），LOD为10~3cfu/mL.（6）分别从DMAC与H_2O作EDC、NHS溶解剂检测154份实际牛肉样品，DMAC为溶解剂可检出阳性样品19份；H_2O为溶解剂可检出阳性样品17份。关键词：液相蛋白芯片论文大肠杆菌O157:H7论文牛肉论文DMAC论文
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中文摘要5-7
Abstract7-13
第1章 绪论13-26

1.1 E.cop O157：H7 概述13-16

1.2 食源性病原菌检测办法探讨发展16-20

1.3 液相芯片检测病原菌的技术概况20-23

1.4 二乙酰胺(DMAC)介绍23-24

1.5 本论文主要探讨内容24-2论文导读：-574.2实验办法57-594.3结果与分析59-604.4讨论60-614.5本章小结61-62第5章E.copO157:H7液相芯片检测办法的建立及初步运用62-745.1材料与设备625.2实验办法62-675.3结果与分析67-725.4讨论725.5本章小结72-74第6章全文结论74-766.1全文总结74-756.2创新点75-76参考文献76-85导师介绍85-86作者介绍86-87攻读硕
6
第2章 E.cop O157:H7 单克隆抗体的制备及鉴定26-47

2.1 材料与设备26-30

2.2 实验办法30-36

2.3 结果与分析36-45

2.4 讨论45

2.5 本章小结45-47

第3章 生物素标记 E.cop O157:H7 多克隆抗体的制备47-56

3.1 材料与设备47

3.2 实验办法47-50

3.3 结果与分析50-55

3.4 讨论55

3.5 本章小结55-56

第4章 E.cop O157：H7 单抗与微球的耦连及 DMAC 对提升微球耦连效率的初步探讨56-62

4.1 材料与设备56-57

4.2 实验办法57-59

4.3 结果与分析59-60

4.4 讨论60-61

4.5 本章小结61-62

第5章 E.cop O157:H7 液相芯片检测办法的建立及初步运用62-74

5.1 材料与设备62

5.2 实验办法62-67

5.3 结果与分析67-72

5.4 讨论72

5.5 本章小结72-74

第6章 全文结论74-76

6.1 全文总结74-75

6.2 创新点75-76

参考文献76-85
导师介绍85-86
作者介绍86-87
攻读硕士期间学术发表论文87-88
致谢88