试述疏水功能化树状大分子及其纳米复合物作为非病毒载体用于基因传递科技

论文导读：径进行表征；采取凝胶阻滞实验确定材料对质粒DNA的包裹封装能力；MTT细胞毒性实验对材料的细胞相容性进行评估；最后利用模型细胞(Hela细胞)不断优化参数,找到最适的转染N/P比,探讨载体的转染效率和细胞内吞效率。实验结果表明：G5.NH2-Cn/pDNA复合物的粒径和电势是适于细胞内吞的,生物相容性虽然没有较大改善,在N/P=1的情况下转
摘要：基因治疗是一种将核酸作为药物输送到特定细胞或组织以达到修复缺陷基因及治疗疾病的策略。目前,在基因传递领域进展高效低毒的非病毒载体仍是一项非常具有挑战性的探讨工作,而进展一种具有高效转染效率或具有靶向功能的纳米载体,实现治疗基因的靶向运输,提升治疗的特异性,也已成为必定的探讨走势。在本项探讨中,我们报道了两种基于聚酰胺-胺(Poly (amidoamine) dendrimers, PAMAM)树状大分子的新型基因载体,即烷基化修饰的聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH2-Cn,(n代表碳原子数目,n=6或12))和包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺-胺树状大分子载体(Au DENPs-FA),分别以没有烷基化修饰的第五代PAMAM树状大分子(G5.NH2)以及没有叶酸修饰的包裹纳米金颗粒的聚酰胺-胺树状大分子(Au DENPs)作为对照探讨这两类修饰过的材料作为基因载体的可行性。本课题主要包含以下探讨内容：以第五代PAMAM树状大分子为模板,用环氧已烷或环氧十二烷修饰得到碳链长度不同的G5.NH2-Cn,以及通过制约氯金酸／树状大分子摩尔比为25：1合成得到具有靶向基因传递功能的Au DENPs-FA。在不同N/P下将材料与质粒DNA混匀形成载体/pDNA复合物,对复合物的电势和粒径进行表征；采取凝胶阻滞实验确定材料对质粒DNA的包裹封装能力；MTT细胞毒性实验对材料的细胞相容性进行评估；最后利用模型细胞(Hela细胞)不断优化参数,找到最适的转染N/P比,探讨载体的转染效率和细胞内吞效率。实验结果表明：G5.NH2-Cn/pDNA复合物的粒径和电势是适于细胞内吞的,生物相容性虽然没有较大改善,在N/P=1的情况下转染活性有了显著增强,内吞效率也有一定提升；Au DENPs-FA不仅可以高效压缩质粒DNA,在N/P=0.5时就可以完全压缩DNA,而且转染效率大大提升,细胞相容性也有了一定改善,在N/P=2.5时转染效率是没有修饰叶酸的AuDENPs的两倍以上,叶酸受体屏蔽实验结果表明Au DENPs-FA与AuDENPs的效率相当,说明修饰了叶酸分子的Au DENPs-FA可实现基因的靶向传递,这为其作为基因载体在生物医学上的运用奠定了基础。关键词：PAMAM树状大分子论文叶酸靶向基因传递论文疏水化修饰论文
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ABSTRACT7-13
第一章 绪论13-36

1.1 基因治疗13-26

1.1 基因治疗的概念13

1.2 基因治疗的进展及探讨近况13-15

1.3 基因治疗的策略和步骤15-16

1.4 基因传递历程16-22

1.4.1 基因传递历程的障碍16-20

1.4.2 基因传递历程复合物跨越障碍的可能的策略和途径20-22

1.5 基因治疗的运用22-23

1.5.1 基因治疗在肿瘤疾病中的运用22

1.5.2 基因治疗在组织工程中的运用22-23

1.6 基因治疗中待解决的关键不足23

1.7 基因治疗载体的种类及理想载体的特点23-26

1.7.1 病毒载体23-24

1.7.2 非病毒载体24-26

1.2 阳离子聚合物载体PAMAM26-31

1.2.1 PAMAM的探讨背景26-28

1.2.2 PAMAM的性质及在生物医药领域的运用28-30

1.2.3 PAMAM作为基因载体的探讨近况30-31

1.3 聚酰胺-胺型树状大分子包裹的纳米金颗粒(Dendrimer-Entrapped GoldNanoparticles,Au DENPs)31-32

1.4 疏水化修饰载体探讨进展32-33

1.5 叶酸靶向的基因治疗33-35

1.6 本论文的探讨作用与目标35-36

第二章 烷基化PAMAM树状大分子的修饰及复合物的制备与表征36-47

2.1 引言36-37

2.2 实验材料和策略37-42

2.1 实验试剂和设备37

2.2 烷基化PAMAM树状大分子的合成37-38

2.3 烷基化PAMAM树状大分子的表征38

2.3.1 ~1H NMR表征38

2.3.2 末端氨基定量38

2.2论文导读：624.3.5粒径分布62-634.3.6电势分布634.4小结63-65第五章AuDENPs-FA的细胞毒性以及转染效率的探讨65-745.1引言655.2实验试剂和仪器设备65-665.3实验策略66-675.3.1MTT细胞毒性实验665.3.2细胞转染实验66-675.3.2.1荧光素酶表达实验665.3.2.2绿色荧光蛋白表达实验66-675.3.3细胞内吞实验675.3.4叶酸受体屏蔽实
.4 质粒抽提与标记38-41

2.5 G5.NH_2-Cn/pDNA复合物的制备与表征41-42

2.5.1 G5.NH_2-Cn/pDNA复合物的制备41

2.5.2 凝胶阻滞试验41-42

2.5.3 粒径与Zeta电势的测定42

2.3 实验结果与讨论42-46

2.3.1 ~1H NMR表征42

2.3.2 末端氨基定量42-43

2.3.3 质粒抽提与标记43

2.3.4 凝胶阻滞试验43-44

2.3.5 粒径与Zeta电势44-46

2.4 小结46-47

第三章 烷基化PAMAM树状大分子的细胞毒性以及转染效率的探讨47-55

3.1 引言47

3.2 实验试剂和仪器设备47-48

3.3 实验策略48-49

3.1 MTT细胞毒性实验48

3.2 细胞转染实验48-49

3.3.

2.1 荧光素酶表达实验48-49

3.3.

2.2 绿色荧光蛋白表达实验49

3.3.3 细胞内吞实验49

3.4 实验结果与讨论49-54

3.4.1 细胞毒性49-50

3.4.2 细胞转染效率评价50-52

3.4.

2.1 荧光素酶表达实验50-51

3.4.

2.2 绿色荧光蛋白表达实验51-52

3.4.3 细胞内吞实验52-54

3.5. 小结54-55

第四章 包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺-胺树状大分子(Au DENPs-FA)的制备及Au DENPs-FA/DNA复合物的制备与表征55-65

4.1 引言55-56

4.2 实验材料和策略56-59

4.

2.1 实验试剂和设备56-57

4.

2.2 Au DENPs与AuDENPs-FA的合成57

4.

2.3 Au DENPs-FA与Au DENPs的表征57-58

4.

2.3.1 UV-Vis和1H NMR表征57-58

4.

2.3.2 末端氨基定量58

4.2.3.3 透射电子显微镜(Tranission Electron Microscope,TEM)58
4.

2.4 质粒抽提与标记58

4.

2.5 不同比例Au DNEPs-FA/DNA复合物的制备58

4.

2.6 Au DENPs-FA/DNA复合物的凝胶阻滞试验58

4.

2.7 粒径与Zeta电势的测定58-59

4.3 实验结果与讨论59-63
4.

3.1 UV-Vis和~1H NMR表征结果59-60

4.

3.2 氨基定量60-61

4.3.3 透射电子显微镜(Tranission Electron Microscope,TEM)61
4.

3.4 Au DENPs-FA与pDNA的结合情况61-62

4.

3.5 粒径分布62-63

4.

3.6 电势分布63

4.4 小结63-65
第五章 Au DENPs-FA的细胞毒性以及转染效率的探讨65-74

5.1 引言65

5.2 实验试剂和仪器设备65-66

5.3 实验策略66-67

5.

3.1 MTT细胞毒性实验66

5.

3.2 细胞转染实验66-67

5.3.

2.1 荧光素酶表达实验66

5.3.

2.2 绿色荧光蛋白表达实验66-67

5.3.3 细胞内吞实验67
5.

3.4 叶酸受体屏蔽实验67

5.

4. 结果与讨论67-72

5.

4.1 细胞毒性实验67-68

5.

4.2 细胞转染评价68-70

5.4.

2.1 荧光素酶表达实验68-69

5.4.

2.2 绿色荧光蛋白表达实验69-70

5.4.3 细胞内吞实验70-72

5.

4.4 细胞靶向转染的评价72

5 小结72-74 第六章 结论与展望74-76
参考文献76-82
攻读硕士期间发表的文章82-83
致谢83