极地适冷菌Psychrobacter sp.G低温脂肪酶基因克隆与异源表达

论文片段—的质粒(pKJE7、pG-Tf2和pG-KJE8)共表达后能提高LIP-948的可溶性表达。当与编码分子伴侣最多的质粒pG-KJE8共表达后,可溶性LIP-948比例达到19.8%,且酶活达到108.77U/mg。亲和层析了纯化的低温脂肪酶LIP-948,并对其了酶学性质研究。结果,LIP-948的最适反应温度为35℃,最适pH为8,热稳定性较差,在50℃保温15min酶活即下降;金属离极地微生物论文,低温脂肪酶论文,基因克隆与异源表达论文,分子伴侣论文,可溶性表达论文,酶性质论文,
摘要：南极是一个终年低温、对生命充满挑战的地方,在恶劣环境下生存的微生物经过长期的进化产生了适应低温环境的生命特征,如细胞生物膜的组成变化,蛋白质结构和功能的调整等图书馆论文。南极嗜冷/适冷微生物产生的低温酶具有独特的生理生化特征,即具有极高的催化常数(K_(cat))值,同时具有较低和较稳定的米氏常数(K_m)值,其主要特征是具有较低的活化能和低温下的酶活力。在某些领域中温酶所不可比拟的优越性。本研究构建产低温脂肪酶活力较高的南极适冷菌Psychrobacter sp. G的基因组DNA质粒文库,利用鸟法克隆到两个包含调控区在内的开放读码框架分别为1452 bp (Lip-1452)和948 bp (Lip-948)的低温脂肪酶全长基因。由基因序列推测的两个脂肪酶的氨基酸序列的N端均包含了以丝氨酸为活性中心的保守五肽(Lip-1452,GDSAG;Lip-948,GNG)和保守二肽His-Gly。蛋白序列比对和保守区分析,这两个脂肪酶分别属于细菌脂肪酶家族Ⅳ和Ⅴ毕业设计论文模板。将低温脂肪酶基因Lip-1452和Lip-948分别克隆到表达载体pColdⅢ中,并转化大肠杆菌E. cop BL21(DE3),酶活力测定结果基因Lip-948异源表达后酶活力较高。将Lip-948分别克隆到不同的表达载体pColdⅠ、pET32a、pMAL-x中,转化大肠杆菌E. cop BL21(DE3)中并了诱导表达。SDS-PAGE均实现了Lip-948在E. cop的中异源表达,不同表达载体对LIP-948可溶性表达不同,在上述三种载体中可溶性表达脂肪酶占总脂肪酶蛋白的比例分别为4.5%、18.0%、55.6%;细胞破碎液上清酶活力分别为5.33 U/mL、5.83 U/mL、5.83 U/mL。对重组菌pColdⅢ+ Lip-948/BL21(DE3)产酶条件了优化,结果,诱导物IPTG最佳终浓度为0.5 mmol/L,诱导时的菌体浓度OD600为0.4-0.6,最佳培养温度为15℃,最佳诱导时间为24 h。将重组质粒pColdⅠ+ Lip-948分别与不同分子伴侣质粒如pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16在E. cop BL21(DE3)中了共表达研究。结果,与5种不同的分子伴侣共表达在不同上增加或减少脂肪酶LIP-948的可溶性表达市场营销论文。与分子伴侣质粒pTf16和pGro7共表达后减少LIP-948的可溶性表达,而与编码多个分子伴侣的质粒(pKJE7、pG-Tf2和pG-KJE8)共表达后能提高LIP-948的可溶性表达。当与编码分子伴侣最多的质粒pG-KJE8共表达后,可溶性LIP-948比例达到19.8%,且酶活达到108.77U/mg标准论文。亲和层析了纯化的低温脂肪酶LIP-948,并对其了酶学性质研究。结果,LIP-948的最适反应温度为35℃,最适pH为8,热稳定性较差,在50℃保温15 min酶活即下降;金属离子Sr~(2+)和Ca~(2+)提高LIP-948的酶活力;该酶更倾向于降解短C链的4-Nitrophenyl底物。关键词：极地微生物论文低温脂肪酶论文基因克隆与异源表达论文分子伴侣论文可溶性表达论文酶性质论文
摘要4-6
Abstract6-10
1 前言10-25

1.1 极地微生物与低温酶10-14

1.1 极地微生物的分类11

1.2 极地微生物的适冷机制11-12

1.3 低温酶的化学反应特征12-13

1.4 低温酶的分子结构假说13-14

1.2 低温脂肪酶14-24

1.2.1 脂肪酶简介14-15

1.2.2 低温脂肪酶来源及克隆15-17

1.2.3 低温脂肪酶的异源表达17-23

1.2.4 低温脂肪酶的应用23-24

1.3 本课题的研究目的和24-25

2 Psychrobacter sp. G 基因组DNA 质粒文库的构建与低温脂肪酶基因的克隆25-40

2.1 与方法25-29

2.

1.1 菌株与试剂25

2.

1.2 基因组DNA 提取25-26

2.

1.3 基因组DNA 酶切26-27

2.

1.4 基因组DNA 片段与pUC118 HincⅡ/BAP 载体连接27

2.

1.5 连接产物转化27-28

2.

1.6 菌落PCR 检测和测序验证28

2.

1.7 产低温脂肪酶阳性克隆的筛选28

2.

1.8 产低温脂肪酶基因序列分析28-29

2.2 结果29-37

2.1 基因组DNA 电泳检测29

2.2 菌落PCR 检测和测序验证29-30

2.2.3 南极适冷菌Psychrobacter sp. G 低温脂肪酶基因的序列分析30-36

2.4 低温脂肪酶的3D 结构预测36-37

2.3 讨论37-39

2.4 小结39-40

3 异源表达载体的筛选及分子伴侣共表达40-65

3.1 与方法40-51

3.

1.1 菌株和质粒40-41

3.

1.2 重组质粒构建试剂41

3.

1.3 核酸电泳试剂41-42

3.

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂42

3.

1.5 Western blot 试剂42-43

3.

1.6 原核表达载体的构建43-46

3.

1.7 重组菌的诱导表达及异源表达载体的筛选46

3.

1.8 重组菌的诱导表达及最佳诱导条件的探索46-47

3.

1.9 脂肪酶酶活检测及蛋白浓度测定47-48

3.

1.10 SDS-PAGE 检测蛋白表达48-49

3.

1.11 分子伴侣共表达49-50

3.

1.12 Western blot 检测50-51

3.2 结果51-61
3.

2.1 产低温脂肪酶重组菌的构建51-52

3.

2.2 低温脂肪酶基因Lip-1452 克隆到pColdⅢ载体中的表达52-53

3.

2.3 低温脂肪酶基因Lip-948 在pColdⅢ载体中的表达53-54

3.2.4 低温脂肪酶基因Lip-948 在pColdⅠ载体中的表达论文片段—化65-664.1.3重组脂肪酶酶学性质66-674.2结果与分析67-714.2.1低温脂肪酶pColdⅠ+Lip-948的纯化67-684.2.2温度对酶活的影响68-694.2.H对酶活的影响69-704.2.4金属离子对酶活的影响704.2.5底物特异性70-714.3讨论71-734.4小结73-745总结与展望74-775.1总结74-755.2展望75-77参考文献77-86硕士期间发表文章86极地微生物论文,低温脂肪酶论文,基因克隆与异源表达论文,分子伴侣论文,可溶性表达论文,酶性质论文,
54
3.

2.5 低温脂肪酶基因Lip-948 在pMAL-x 载体中的表达54-55

3.

2.6 低温脂肪酶基因Lip-948 在pET32a 载体中的表达55-56

3.

2.7 最佳诱导表达条件探索56-59

3.

2.8 分子伴侣共表达59-61

3.3 讨论61-63

3.4 小结63-65

4 低温脂肪酶LIP-948 的分离纯化与酶学性质研究65-74

4.1 与方法65-67

4.

1.1 菌株和试剂65

4.

1.2 重组脂肪酶的纯化65-66

4.

1.3 重组脂肪酶酶学性质66-67

4.2 结果与分析67-71
4.

2.1 低温脂肪酶pColdⅠ+Lip-948 的纯化67-68

4.

2.2 温度对酶活的影响68-69

4.

2.3 pH 对酶活的影响69-70

4.

2.4 金属离子对酶活的影响70

4.

2.5 底物特异性70-71

4.3 讨论71-73

4.4 小结73-74

5 总结与展望74-77

5.1 总结74-75

5.2 展望75-77

参考文献77-86
硕士期间发表文章86-87
致谢87