阐释光能嗜热光合绿丝菌色素结合蛋白CA异源表达和功能初步
最后更新时间:2024-02-26
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论文导读:
摘要:嗜热不放氧光合细菌Chloroflexus aurantiacus是最早发现的绿色非硫细菌,它和绿硫细菌最大的共性就是都有捕光天线——绿小体的有着。绿小体是生物体中最大的捕光天线结构,由单层膜包被,内部是细菌叶绿素c聚集形成的管状结构。细菌叶绿素c捕获光能后将能量传递给膜上的细菌叶绿素a,进而传递给光合反应中心。基片层(baseplate)是位于绿小体与细胞膜结合处的特殊构件,不仅起着连接的作用,同时也是绿小体内捕获的光能传递进入光合膜的重要调控枢纽。前期探讨中发现基片层主要成分是CA蛋白。为了阐明基片层在光能传递历程中的机制和作用,需要深入探讨CA蛋白。本探讨采取分子生物学和蛋白质化学等技术对CA蛋白展开了如下探讨:(1)以Cfx. aurantiacus基因组为模板,根据NCBI中已知的Cfx. aurantiacus的cA基因序列设计了特异性引物,PCR扩增后TA克隆进而重组到表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源过表达;(2)用双引物法对CA蛋白的第25位氨基酸残基进行了定点突变,突变为不带电荷的丙氨酸(Ala),成功构建了突变型CAH25A蛋白的表达载体,用来探究CA蛋白的色素结合位点;(3)标签蛋白经IPTG诱导表达后,发现主要以包涵体形式有着。由此,进行了在Ni-NAT柱上的包涵体复性和凝血酶酶切等实验。结果表明:表达的标签蛋白结合到亲和柱上后,在低温16℃、低流速(0.5ml/min)和温和的尿素梯度(8M-0M)等条件下,可以成功复性目的蛋白,复性效率达41%。凝血酶的柱上酶切效率在室温16℃、反应20h和每克目的蛋白加0.7U的凝血酶量时达到最高。(4)复性纯化的两种蛋白分别与HPLC制备的细菌叶绿素a进行体外功能重组后,利用吸收光谱等手段对重组产物进行初步浅析和鉴定,结果表明CA的第25位组氨酸残基是细菌叶绿素a结合的关键位点。本探讨将为嗜热光合绿丝菌绿小体基片层结构与功能的进一步探讨提供论述基础。关键词:CA蛋白论文表达与纯化论文定点突变论文光能传递论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。致谢5-6
摘要6-7
Abstract7-9
目次9-13
第一章 引言13-27
3.
4.
4.
第五章 CA蛋白和CAH25A蛋白与细菌叶绿素a的体外重组69-74
参考文献74-81
附录81-83
缩略语83-84
作者介绍84
摘要:嗜热不放氧光合细菌Chloroflexus aurantiacus是最早发现的绿色非硫细菌,它和绿硫细菌最大的共性就是都有捕光天线——绿小体的有着。绿小体是生物体中最大的捕光天线结构,由单层膜包被,内部是细菌叶绿素c聚集形成的管状结构。细菌叶绿素c捕获光能后将能量传递给膜上的细菌叶绿素a,进而传递给光合反应中心。基片层(baseplate)是位于绿小体与细胞膜结合处的特殊构件,不仅起着连接的作用,同时也是绿小体内捕获的光能传递进入光合膜的重要调控枢纽。前期探讨中发现基片层主要成分是CA蛋白。为了阐明基片层在光能传递历程中的机制和作用,需要深入探讨CA蛋白。本探讨采取分子生物学和蛋白质化学等技术对CA蛋白展开了如下探讨:(1)以Cfx. aurantiacus基因组为模板,根据NCBI中已知的Cfx. aurantiacus的cA基因序列设计了特异性引物,PCR扩增后TA克隆进而重组到表达载体pET28a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源过表达;(2)用双引物法对CA蛋白的第25位氨基酸残基进行了定点突变,突变为不带电荷的丙氨酸(Ala),成功构建了突变型CAH25A蛋白的表达载体,用来探究CA蛋白的色素结合位点;(3)标签蛋白经IPTG诱导表达后,发现主要以包涵体形式有着。由此,进行了在Ni-NAT柱上的包涵体复性和凝血酶酶切等实验。结果表明:表达的标签蛋白结合到亲和柱上后,在低温16℃、低流速(0.5ml/min)和温和的尿素梯度(8M-0M)等条件下,可以成功复性目的蛋白,复性效率达41%。凝血酶的柱上酶切效率在室温16℃、反应20h和每克目的蛋白加0.7U的凝血酶量时达到最高。(4)复性纯化的两种蛋白分别与HPLC制备的细菌叶绿素a进行体外功能重组后,利用吸收光谱等手段对重组产物进行初步浅析和鉴定,结果表明CA的第25位组氨酸残基是细菌叶绿素a结合的关键位点。本探讨将为嗜热光合绿丝菌绿小体基片层结构与功能的进一步探讨提供论述基础。关键词:CA蛋白论文表达与纯化论文定点突变论文光能传递论文
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摘要6-7
Abstract7-9
目次9-13
第一章 引言13-27
1.1 不放氧光合细菌概述13-17
1.1 光合细菌的分类13-14
1.2 不放氧光合细菌的分布14-15
1.3 丝状光合细菌与植物的光合机制的异同15-17
1.2 嗜热绿色光合细菌Chloroflexus aurantiacus概述17-241.2.1 绿小体18-20
1.2.2 色素结合蛋白CA20-22
1.2.3 CA蛋白与细菌叶绿素a的结合22-24
1.3 论文探讨作用和技术路线24-27
1.3.1 实验设计思路24-25
1.3.2 实验主要内容25-26
1.3.3 技术路线26-27
第二章 色素结合蛋白CA的基因克隆和定点突变27-452.1 实验材料27-31
2.1.1 主要实验仪器27
2.1.2 主要实验试剂27-28
2.1.3 培养基、试剂的配制28-30
2.1.4 载体图谱30-31
2.2 实验策略31-382.1 光合细菌的培养31
2.2 细菌基因组的提取(CTAB法)31-32
2.3 PCR扩增目的片段32-34
2.4 PCR产物的胶回收34-35
2.5 PCR产物连接T载体35
2.6 重组T载体转化E.cop感受态细胞Transl-T135-36
2.7 阳性菌落的PCR鉴定36
2.8 重组质粒的提取36-37
2.9 重组T质粒、表达载体的双酶切37
2.10 目的基因连接表达载体37-38
2.11 连接产物转化E.cop感受态细胞BL21(DE3)38
2.3 实验结果38-43
2.3.1 绿小体色素结合蛋白cA基因的扩增38-39
2.3.2 重组T载体转化大肠杆菌菌落PCR鉴定39
2.3.3 重组T载体和表达载体的双酶切39-40
2.3.4 酶切产物的连接及阳性菌落的鉴定40
2.3.5 cA基因的“双引物法”定点突论文导读:
变40-422.3.6 重组T载体pEASYT1-cAH25A及其鉴定42
2.3.7 重组T载体和表达载体的双酶切42-43
2.3.8 重组pET28a-cAH25A表达载体的菌落PCR鉴定43
2.4 小结与讨论43-45
第三章 色素结合蛋白CA的复性和纯化45-623.1 实验材料45-48
3.1.1 主要实验仪器45
3.1.2 主要实验试剂45-46
3.1.3 试剂的配制46-48
3.2 实验策略48-513.
2.1 TricineSDS-PAGE的配制、上样及染色48
3.2.2 目的蛋白的诱导48-49
3.2.3 目的蛋白表达位置的确定49
3.2.4 目的蛋白表达条件的优化49
3.2.5 His SpinTrap的预纯化49-50
3.2.6 包涵体的提取与变性50
3.2.7 BCA法蛋白浓度的测定50-51
3.2.8 包涵体的Ni柱纯化和柱上复性51
3.2.9 凝血酶柱切51
3.3 实验结果51-603.1 CA蛋白表达定位浅析51-52
3.2 CA蛋白可溶表达条件优化52-53
3.3 CA蛋白包涵体的预纯化53-54
3.4 CA蛋白包涵体的梯度洗脱54-55
3.5 包涵体的柱上复性及纯化55-56
3.6 复性后CA蛋白浓度BCA测定56
3.7 CAH25A蛋白表达定位浅析56-57
3.8 CAH25A蛋白的预纯化57
3.9 CAH25A蛋白的柱上复性及纯化57-58
3.10 CA和CAH25A蛋白的凝血酶酶切58-60
3.4 小结与讨论60-62
第四章 细菌叶绿素a的HPLC浅析和制备62-694.1 实验材料62-63
4.1.1 主要实验仪器62
4.1.2 主要实验试剂62-63
4.1.3 试剂的配制63
4.2 实验策略63-644.
2.1 RfX castenholzii的全色素提取63
4.2.2 Rfx castenholzii细菌叶绿素a的浅析63-64
4.2.3 Rfx castenholzii细菌叶绿素a的制备64
4.2.4 细菌叶绿素a的冷冻干燥和浓度测定64
4.2.5 蔗糖密度梯度离心提取绿小体64
4.3 实验结果64-684.
3.1 RfX.castenholzii细菌叶绿素a的浅析64-65
4.3.2 RfX.castenholzii细菌叶绿素a的制备65-66
4.3.3 RfX.castenholzii细菌叶绿素a的浓缩66-67
4.3.4 蔗糖密度梯度离心提取绿小体67-68
4.4 小结与讨论68-69第五章 CA蛋白和CAH25A蛋白与细菌叶绿素a的体外重组69-74
5.1 实验材料69
5.1.1 主要实验仪器69
5.1.2 主要实验试剂69
5.1.3 试剂的配置69
5.2 实验策略69-705.3 实验结果70-72
5.3.1 CA融合蛋白与细菌叶绿素a体外重组前后吸收光谱浅析70-71
5.3.2 CA与细菌叶绿素a体外重组前后吸收光谱浅析71
5.3.3 CAH25A与细菌叶绿素a体外重组前后吸收光谱浅析71-72
5.4 小结与讨论72-74参考文献74-81
附录81-83
缩略语83-84
作者介绍84