试析血红素糖尿病合并冠心病患者血红素氧化酶—1基因多态性表达及其作用技巧

论文导读：空腹血糖（FPG）、餐后2h时血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平比较，差异均无统计学意义（均P>0.05），具有可比性。见表1。1.2方法1.2.1体检和生化检查所有患者入院后测量身高、体重、腰围、臀围和血压，计算BMI。禁食10h后采空腹静脉血，测定血常规、TC、LDL-C、FPG、
[摘要] 目的 研究糖尿病患者血红素氧化酶-1（HO-1）基因多态性及HO-1表达水平与冠心病易感性的关系。 方法 选择经冠状动脉造影证实为冠心病或排除冠心病的糖尿病患者分别为62例和59例，采用聚合酶链反应（PCR）检测HO-1启动子区GT重复[（GT）n]多态性并进行基因分型，用蛋白质印迹法（Western blot）测HO-1的表达水平。 结果 （GT）n重复次数在14～39之间，将（GT）n重复序列分为S（n<27）和L（n≥27）两种等位基因，SS、SL、LL 3种基因型，冠心病组的S等位基因明显少于对照组（P < 0.01），SS基因型亦明显少于对照组（P < 0.05）；冠心病组HO-1蛋白表达明显低于对照组（P < 0.01）。 结论 糖尿病人群中，HO-1的基因多态性与冠心病易感相关，拥有长重复序列（L等位基因）者，其HO-1表达水平明显减低，为冠心病易感人群。
[关键词] 血红素氧化酶-1；基因多态性；冠心病；糖尿病
[] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（c）-0018-03
糖尿病血管病变是严重影响糖尿病患者生命质量及致死、致残的主要原因。但临床上发现糖尿病患者冠心病的发生与血糖水平并不相关，英国前瞻性糖尿病研究（UKPDS）亦证明单纯血糖控制并不能达到减少糖尿病大血管合并症的目的。高血糖引起的氧化应激是糖尿病动脉粥样硬化发生的主要原因，抗氧化可延缓动脉粥样硬化的发生。血红素氧化酶-1（HO-1）是细胞保护蛋白，它分解血红素产生的一氧化碳（CO）、游离铁和胆红素，具有抗氧化、抗炎作用，可保护血管免受氧化应激及炎症介质的损伤。HO-1基因启动子区内包含着一个由GT二核苷酸重复组成的（GT）n短串联重复序列（STR）多态性，人HO-1基因启动区所特有微卫星结构的（GT）n长度直接影响HO-1基因的转录水平，HO-1启动子区GT短重复序列人体内的HO-1表达水平更高。本课题探讨2型糖尿病（T2DM）患者HO-1基因多态性、单核细胞中HO-1的表达水平，评价HO-1基因多态性及HO-1表达水平与冠心病的相关性，为进一步研究如何调节HO-1的表达，从而应用于临床治疗提供理论依据。
1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年6月～2011年10月，选择在福建医科大学附属南平市第一医院住院经冠状动脉造影证实合并有冠心病的糖尿病患者62例作为冠心病组，其中，急性心肌梗死2例，陈旧性心肌梗死5例，不稳定型心绞痛20例，稳定型心绞痛35例；另选择性别、年龄与冠心病组相仿，经冠脉造影证实无冠脉明显狭窄的单纯糖尿病患者59例作为对照组。其中，冠心病组62例，男35例，女27例，平均年龄（62.0±3.2）岁，合并高血压30例、吸烟17例；对照组59例，男31例，女28例，平均年龄（63.0±2.9）岁，合并高血压36例、吸烟18例。两组年龄、性别、吸烟、体重指数（BMI）、血压、空腹血糖（FPG）、餐后2 h时血糖（2 h PG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05），具有可比性。见表1。

1.2 方法

1.2.1 体检和生化检查 所有患者入院后测量身高、体重、腰围、臀围和血压，计算BMI。禁食10 h后采空腹静脉血，测定血常规、TC、LDL-C、FPG、HbA1c及2 h PG。
1.2.2 冠状动脉造影检查 利用飞利浦公司DSA，采用经桡动脉或股动脉穿刺法进行冠状动脉造影，对每支血管进行最佳的多体位造影，以直径狭窄百分数对其进行评估。有一条主要冠状动脉直径狭窄百分数>50% 诊断为冠心病，冠状动脉直径狭窄百分数<20%为正常。
1.2.3 HO-1 启动子区（GT）n检测及分型 采用荧光标记PCR 以及毛细管电泳相结合技术进行基因分型。取研究对象外周抗凝血5 mL，分离淋巴细胞和单核细胞。源于：论文要求www.7ctime.com
分离单个核细胞后，采用QIAGEN试剂盒提取细胞基因组DNA。primer5.0软件设计扩增启动子区引物。引物序列如下：正向：5'-GGATTCCAGCAGGTGACATT-3'；反向：5'-ACAGCTGATGCCCACTT TCT-3'。25 ML体系PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环35次，最后72℃延伸10 min。PCR 产物纯化后采用ABI公司3730进行毛细管电泳，run 3730 data collection v2.0收集毛细管电泳荧光信号，GeneMapper Software v3.5软件对论文导读：ot测HO-1的表达应用单去污剂裂解液提取单个核细胞蛋白质，利用BCA法测定蛋白含量，以每孔50μg蛋白量加样，稳压125V在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再进行蛋白质的电转移（转移槽50V转膜1h）。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。将膜分别与一抗、二抗反应（HO-1一抗稀释度1∶500，β-actin一抗稀释度1∶1000，二抗稀释度1∶500，室温下反
峰图进行分型（重复次数），确定（GT）n多态性的多态。（GT）重复次数<27，为S等位基因，（GT）重复次数≥27，为L等位基因，分别构成SS、SL、LL这3种基因型[3]。
1.2.4 Western blot测HO-1的表达 应用单去污剂裂解液提取单个核细胞蛋白质，利用BCA法测定蛋白含量，以每孔50 μg蛋白量加样，稳压125 V在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再进行蛋白质的电转移（转移槽50 V转膜1 h）。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。将膜分别与一抗、二抗反应（HO-1一抗稀释度1∶500，β-actin一抗稀释度1∶1000，二抗稀释度1∶500，室温下反应2 h）。免疫反应后将膜盖于发光试剂（北京中杉试剂公司）上反应1 min，暗室3～5 min，X线片经显影、定影后待检。结果扫描进计算机，用Image-ProPlus自动图像分析软件（Version：4.5）对HO-1光带进行分析，以HO-1蛋白带的灰度峰值代表HO-1的表达量[4]。

1.3 统计学方法源于：论文的格式要求www.7ctime.com