浅论关联性中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度相关候选基因筛选及其关联性

论文导读：肤组织中KRT26等上调基因的表达量越高,反之亦然。3.TXNIP和KRT26基因多态性及其与羊毛细度的关联性浅析：本实验首次采取PCR.SSCP技术检测TXNIP和KRT26两个候选基因在中国美利奴羊(新疆型)群体中的SNP位点,浅析该基因遗传多态性和其与羊毛细度的相关性。结果表明：TXNlP和KRT26基因均有AA、AB、BB三种基因型；TXNIP基因检测到2处
摘要：羊毛细度是决定羊毛的关键性因素,皮肤毛囊是羊毛生长的基础,对其发生和发育的探讨是重点领域之一。寻找影响羊毛生长的闪素、探明主效基因的调控机理,筛选出可以用来标记绵羊产毛性能的分子标记,以而为进一步开展分子育种工作奠定基础。本探讨是在课题组成员利用表达谱芯片检测细毛羊纤维直径相关候选基因的基础上,建立了适于定量检测绵羊皮肤组织中nRNA表达的实时荧光定量PCR策略,并用该策略检测了14个候选基因在超细型和细型细毛羊皮肤组织中的mRNA表达差别,以基因水平探讨了候选基因的表达变化及其与羊毛细度之间的内在联系,并检测了TXNIP.KRT26基因的SNP位点,浅析了该基因与羊毛细度的关联性。本探讨获得的主要成果如下：1.绵羊皮肤组织中内参基因的筛选：本实验利用RT-PCR技术,以GeneBank中查找绵羊的6个候选内参基因,获得相应的扩增片段,分别为18SrRNA:185bp、β-Actin:225bp.GAPDH:181bp、B2M：138bp、TBP：186bp、RPL13A：81bp。采取geNorm软件筛选最适合绵羊皮肤组织的内参基因。筛选结果为：内参基因的最适数目为3个,将B2M、RPL13A、TBP、18S rRNA.ACTB/GAPDH内参基因的表达稳定度的平均M值依次为：0.5360.4800.4760.4720.371,表达稳定度由低到高：最终确定了在绵羊皮肤组织中以18SrRNA.β-Actin和GAPDH三个看家基因作为内参基因最理想,并据此建立了基于SYBR Green染料技术适于绵羊皮肤组织中mRNA表达定量检测的RT-PCR策略,即实时荧光定量PCR。2.实时荧光定量PCR法筛选羊毛细度相关的候选基因：本实验采取实验一建立的RT-PCR策略检测了TXNIP、KRT26、PIK3CA、PPARD、FZD3、TFDP1、PTPN13、RPS6KA、ABCG2、ADAM9、GJB3、GSTA1、FAIM、LAMB1等14个基因在超细型和细型细毛羊皮肤组织中的相对表达。检测结果表明：14个候选基因在绵羊的皮肤组织中均有表达,与细型细毛羊相比,超细型细毛羊皮肤组织中表达上调的基因是KRT26、TXNIP、TFDP1、FAIM;而表达下调的基因是PIK3CA.ADAM9.FZD3,即羊毛细度越细,其皮肤组织中KRT26等上调基因的表达量越高,反之亦然。3.TXNIP和KRT26基因多态性及其与羊毛细度的关联性浅析：本实验首次采取PCR.SSCP技术检测TXNIP和KRT26两个候选基因在中国美利奴羊(新疆型)群体中的SNP位点,浅析该基因遗传多态性和其与羊毛细度的相关性。结果表明：TXNlP和KRT26基因均有AA、AB、BB三种基因型；TXNIP基因检测到2处突变,即52bp-/T,86bpG/T均为同义突变,其与羊毛细度差别不显著(P0.05)；KRT26基因出现5处碱基的突变,分别为83bp(G/C),86bp(T/C),112bp(C/T),140bp(G/A),247bp(C/T),前3处为同义突变,后2处发生了氨基酸的替代,即Val/Ile,Asn/Lys,其3种基因型个体之间的羊毛细度差别极显著(P0.01),由此,KRT26基因可以作为绵羊毛细度相关候选基因。关键词：中国美利奴羊(新疆型)论文羊毛细度论文候选基因论文RT-PCR论文关联性论文
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Abstract5-9
第一章 绪论9-26

1.1 绵羊羊毛生产及市场基本情况9-10

1.2 毛囊发生的分子机理10-13

1.2.1 毛囊发生及羊毛生长10-11

1.2.2 毛囊发生的分子机理11-13

1.3 羊毛纤维结构及其组成13-14

1.3.1 羊毛纤维结构13-14

1.3.2 羊毛纤维组成14

1.4 毛囊角蛋白基因表达及调控14-17

1.4.1 毛囊角蛋白分类14-15

1.4.2 中间丝(IF)角蛋白15

1.4.3 角蛋白关联蛋白(中间丝关联蛋白IKAPs)15

1.4.4 角蛋白基因在毛囊中的表达15-16

1.4.5 角蛋白基因的表达论文导读：4讨论37-412.4.1实时荧光定量PCR技术372.4.2转录表达中的内参基因的选择37-402.4.3绵羊皮肤组织中内参基因的选择40-41第三章实时荧光定量PCR法筛选羊毛细度相关的候选基因41-523.1实验材料423.1.1实验羊来源及样品采集423.1.2主要仪器设备423.1.3试剂盒及普通试剂423.1.4缓冲液与溶液的配制423.2实验策略42-443.
调控16-17

1.5 国内外毛性状分子生物学探讨进展17-19

1.5.1 羊毛主要经济性状QTL17-18

1.5.2 羊毛性状的微卫星标记探讨进展18-19

1.6 与毛囊发育相关的差别表达基因19-21

1.7 利用荧光定量PCR技术探讨候选基因的表达21-23

1.7.1 RT-PCR技术原理21

1.7.2 荧光化学21-22

1.7.3 定量策略22-23

1.7.4 实时荧光定量PCR技术运用于基因表达的定量浅析23

1.8 利用PCR-SSCP技术探讨候选基因的多态性及其与性状的关联性23-25

1.8.1 基本原理23-24

1.8.2 在绵羊分子育种方面的运用24-25

1.9 本探讨的作用25-26

第二章 绵羊皮肤组织中内参基因的筛选26-41

2.1 实验材料27-28

2.

1.1 实验羊来源及样品采集27

2.

1.2 主要仪器设备27-28

2.

1.3 试剂盒及普通试剂28

2.

1.4 溶液与缓冲液的配制28

2.2 实验策略28-31

2.1 内参基因引物设计28-29

2.2 绵羊皮肤组织中RNA提取及其检测29

2.3 反转录合成cDNA第一条链29-30

2.4 荧光定量PCR系统的建立及产物检测30

2.5 标准曲线的绘制30-31

2.6 统计浅析31

2.3 结果31-37

2.3.1 皮肤组织中总RNA的提取结果31-32

2.3.2 标准曲线绘制结果32-34

2.3.3 融解曲线浅析结果34

2.3.4 绵羊皮肤组织中内参基因的表达水平34-35

2.3.5 绵羊皮肤组织中最适内参基因的筛选35-37

2.4 讨论37-41

2.4.1 实时荧光定量PCR技术37

2.4.2 转录表达中的内参基因的选择37-40

2.4.3 绵羊皮肤组织中内参基因的选择40-41

第三章 实时荧光定量PCR法筛选羊毛细度相关的候选基因41-52

3.1 实验材料42

3.

1.1 实验羊来源及样品采集42

3.

1.2 主要仪器设备42

3.

1.3 试剂盒及普通试剂42

3.

1.4 缓冲液与溶液的配制42

3.2 实验策略42-44
3.

2.1 候选基因引物设计42-43

3.

2.2 绵羊皮肤组织中RNA提取及其检测43

3.

2.3 反转录合成cDNA第一条链43

3.

2.4 荧光定量PCR系统的建立及产物检测43-44

3.

2.5 标准曲线的绘制44

3.

2.6 统计浅析44

3.3 结果44-47

3.1 PCR扩增产物检测44-45

3.2 标准曲线及熔解曲线结果浅析45-46

3.3 不同细度绵羊皮肤组织中候选基因的表达46-47

3.4 讨论47-52

3.4.1 RT-PCR法筛选与羊毛细度相关候选基因47-48

3.4.2 差别表达基因浅析48-52

第四章 TXNIP和KRT26基因多态性及其与羊毛细度的关联性浅析52-67

4.1 实验材料53-54

4.

1.1 实验羊来源及样品采集53

4.

1.2 主要仪器设备53

4.

1.3 试剂盒及普通试剂53-54

4.

1.4 凝胶电泳所用试剂的配制54

4.2 实验策略54-59
4.

2.1 SNP筛选引物设计54-55

4.

2.2 基因组DNA的提取及其检测55-56

4.

2.3 PCR反应系统的建立及扩增程序56

4.

2.4 12%变性聚丙稀酷胺凝胶电泳56-57

4.

2.5 银染及显色57-58

4.

2.6 PCR产物测序58

4.

2.7 统计浅析58-59

4.3 结果59-63
4.

3.1 血样中DNA的提取结果59

4.

3.2 PCR-SSCP凝胶电泳结果59-60

4.

3.3 TXNIP基因的SNP位点筛查60-61

4.

3.4 KRT26基因的SNP位点筛查61-62

4.

3.5 候选基因的基因型和等位基因频率62-63

4.

3.6 候选基因的多态信息含量、杂合度、有效等位基因数63

4.

3.7 候选基因与羊毛细度的相关性浅析63

4.4 讨论63-67

4.1 TXNIP基因群体遗传结构浅析64

4.2 TXNIP基因与羊毛细度关联浅析64-65

4.3 KRT26基因群体遗传结构浅析65

4.4 KRT26基因与羊毛细度关联浅析65-67

第五章 结论67-68
参考文献68-75
致谢75-76
作者介绍76