谈谈遗传性小鼠先天性白内障新型自发突变基因定位克隆中专

论文导读：
摘要：先天性白内障(congenital cataract)为出生时或出生后第一年内发生的晶状体混浊,临床上0.4%的新生儿患有先天性白内障,是常见的儿童致盲疾病。大约26%～51%的先天性白内障是遗传因素导致的,由此,以分子机制上揭示先天性白内障的发病理由是防治该疾病的根本途径。2006年在ICR×BALB/cJ的F1代群体中,发现2只自发突变导致白内障的小鼠。经与BALB/cJ进一步回交繁育,保持了稳定的显性常染色体遗传特点。本探讨对杂合子与纯合子小鼠进行了性状鉴定,杂合子突变小鼠产生了核型和放射状白内障,而纯合子突变小鼠在刚出生就形成完全白内障。患病小鼠在13天左右出现晶状体混浊、角膜无异常、无行为学异常、无生殖障碍、生长发育也无异常。为定位突变基因,将携带白内障基因BALB/cJ品系与正常C3H/HeJ回交两代,建立了F2代家系,共挑选了83只白内障表型小鼠用于基因鉴定。第一步,通过全基因组扫描,对平均覆盖19条常染色体的共44个遗传位标在上面陈述的群体中分型,将基因定位到1号染色体上D1Mit410(17cM)和D1Mit102(73cM)之间;第二步,在该区段内(56cM长)进一步挑选遗传位标,单倍型浅析结果将白内障基因定位到D1Mit236(25.7cM)和D1Mit46(43.1cM)之间;第三步,选择D1Mit236和D1Mit46之间单倍型不同的样本13个,再次挑选遗传位标D1Mit19(36.9cM)和D1Mit7(41cM)进行分型,将白内障相关基因进一步定位到D1Mit236和D1Mit19之间约11cM内,此区间内有着晶状体蛋白基因Cryg(32cM),故选择Cryg为候选基因。第四步,反转录出Cryg六个亚基的cDNA,cDNA测序浅析发现在白内障纯合子样本的Crygc亚基第3外显子的209bp处缺失一个碱基,该突变在Crygc亚基第3外显子的76位引入终止子,形成截短蛋白。为进一步验证缺失突变是引起白内障的理由,对大样本进行测序和单核苷酸鉴定,结果表明缺失基因型和白内障表型是完全连锁的,由此该突变应该是引起白内障的理由。由于突变位于高度保守的第四个关键基序中,当其变短时,虽然RT-PCR半定量表明Crygc亚基mRNA能正常转录,但翻译成蛋白时,就会影响γC-晶状体蛋白的正常功能。生物信息浅析突变的γC-晶状体蛋白时,突变型蛋白第二结构域的HMM是以1～66,丢失了15个氨基酸,第二结构域中的保守区被破坏、变短,而保守序列对维持蛋白质的结构和功能是相当重要的,变短则影响了晶状体蛋白的功能,可能是形成白内障的理由。在蛋白质三维结构浅析中,γC-突变蛋白的C-末端缺失一个β-折叠,并且在检测结构模型的健康度时,因突变型蛋白以第3外显子的76位氨基酸后缺失,导致原子经验平均力势增加,蛋白结构不稳定。综上所述,无论以基因型与白内障表型的遗传连锁、突变基因本身的性质变化均表明,单碱基缺失是形成该自发突变白内障小鼠的原因。关键词：遗传性白内障论文动物模型论文全基因组扫描论文精细定位论文RT-PCR论文生物信息学论文
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ABSTRACT8-12
第一章 前言12-23

1.1 探讨作用12

1.2 白内障探讨进展12-20

1.2.1 白内障形成机理12-13

1.2.2 白内障相关基因的探讨进展13-15

1.2.3 白内障基因的突变方式15-20

1.3 立题背景20-21

1.3.1 白内障小鼠的来源20

1.3.2 白内障治病基因的定位克隆对策20-21

1.3.3 全基因组STR位标扫描实验原理21

1.3.4 双脱氧链终止法测定DNA序列原理21

1.4 探讨思路21-23

第二章 材料与策略23-40

2.1 材料23-26

2.

1.1 实验群体23

2.

1.2 仪器和试剂23-26

2.2 策略26-39

2.1 遗传方式验证26

2.2 动物模型的构建26

2.3 白内障病理切片的制作26

2.4 小鼠基因组DNA抽提26-27

2.5 全基因组扫描所用F2代小鼠和marker的选择27

2.论文导读：三维结构浅析54-56第四章讨论56-604.1突变基因的遗传方式与同源基因导入同类系564.2形态学、组织学浅析56-574.3基因定位结果574.4突变位点验证57-584.5生物化学特性浅析584.6Crygc基因对于晶状体发育的重要量58-60第五章结论与展望60-62参考文献62-67课题来源67-68上海市科学技术委员会(09140901100)67-68攻读硕士学

2.6 全基因组扫描和精细定位所用STR的选取27-29

2.7 全基因组扫描和精细定位STR的分型案例29-36

2.8 STR片段的凝胶电泳检测36

2.9 目标基因的cDNA测序36-37

2.10 突变位点检测37-38

2.11 RT-PCR半定量38-39

2.12 生物信息学浅析39

2.3 统计学浅析39-40

2.

3.1 突变小鼠的连锁浅析39-40

第三章 结果与浅析40-56

3.1 遗传方式验证结果40

3.2 白内障形态学浅析结果40-43

3.

2.1 前囊和前囊下浅层皮质41

3.

2.2 赤道部41

3.

2.3 核心部41-42

3.

2.4 后囊及后囊下皮质42-43

3.3 基因组DNA抽提结果43-44

3.4 全基因组扫描和精细定位的STR分型结果44-46

3.5 单倍型浅析结果46-47

3.6 候选基因的cDNA测序结果47-49

3.7 突变位点验证结果49

3.8 RT-PCR半定量结果49-50

3.8.1 RNA抽提结果49-50

3.8.2 RT-PCR半定量结果50

3.9 生物信息学浅析结果50-56

3.9.1 理化性质浅析50-51

3.9.2 疏水性浅析51

3.9.3 跨膜结构浅析51-52

3.9.4 蛋白质结构域与功能浅析52-54

3.9.5 蛋白质三维结构浅析54-56

第四章 讨论56-60

4.1 突变基因的遗传方式与同源基因导入同类系56

4.2 形态学、组织学浅析56-57

4.3 基因定位结果57

4.4 突变位点验证57-58

4.5 生物化学特性浅析58

4.6 Crygc基因对于晶状体发育的重要量58-60

第五章 结论与展望60-62
参考文献62-67
课题来源67-68
上海市科学技术委员会(09140901100)67-68
攻读硕士学位期间发表学术论文目录68-69
致谢69