研究蛋白HBV外膜蛋白结构域稳定表达及治疗性抗体

论文导读：前S1/AA21-47区段比较保守，只要这一段完整，变异的病毒就具有传染性。由此，在构建HBV主蛋白疫苗的基础上加入其他蛋白成分，如前S1蛋白、前S2蛋白以及C蛋白等会有助于提升疫苗的免疫原性。乙肝病毒的外膜蛋白在病毒颗粒分泌、附着及入侵新细胞中具有重要的介导作用，而且三种外膜蛋白均有较多的抗原表位。由此，构建同时含有preS
摘要：乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染机体后所引起的疾病。乙肝流行面广、传染性强、易于慢性化和重症化，并且以人类为惟一宿主，由此对人类健康造成了很大伤害。HBV是一种嗜肝DNA病毒，主要有着于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。HBV感染肝细胞的机理比较复杂，尚未完全明确。目前，制约乙型肝炎传播最为直接和有效的措施是接种乙肝疫苗。在HBV感染期间，肝细胞大量分泌20nm的外膜主蛋白颗粒，由细胞系或酵母策略制备的同样颗粒就是有效预防病毒感染的疫苗。乙肝疫苗经历了乙肝病毒外膜主蛋白（即S蛋白，HBsAg）重组疫苗；乙肝病毒外膜主蛋白、中蛋白（前S2蛋白+S蛋白）及大蛋白（前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白）重组疫苗；乙肝DNA疫苗等几个阶段。这些疫苗虽然能够有效地降低HBV母婴传播的发生率，然而在人体保护率、抗体应答水平、免疫持久性等方面还有着一定的不足。由此，寻找免疫原性更强的HBV疫苗成为当前探讨的热点。HBV的外膜由开放读框S基因（S-ORF，核苷酸nt2854-0-832）编码合成，包括3种外膜成分：大蛋白（L），中蛋白（M）和主蛋白（S），它们由1个开放读码框编码，分别利用3个起始子和1个共同的终止子。外膜蛋白主要是由226个氨基酸组成的主蛋白HBsAg，是携带全部抗原反应性的结构蛋白。M是在S的氨基端扩加55个氨基酸（前S2蛋白），前S2蛋白在外膜三种蛋白成分中的免疫原性最强；L是在M前再扩加108-119个氨基酸（前S1蛋白）。病毒附着于肝细胞，最重要的介导部位就是前S1蛋白的氨基端21-47肽段，前S1/AA21-47区段比较保守，只要这一段完整，变异的病毒就具有传染性。由此，在构建HBV主蛋白疫苗的基础上加入其他蛋白成分，如前S1蛋白、前S2蛋白以及C蛋白等会有助于提升疫苗的免疫原性。乙肝病毒的外膜蛋白在病毒颗粒分泌、附着及入侵新细胞中具有重要的介导作用，而且三种外膜蛋白均有较多的抗原表位。由此，构建同时含有preS1、preS2的蛋白可以更好的诱导机体的免疫应答。本课题依照这个思路，以获得具有更高免疫原性的HBV疫苗为目的进行基础性探讨，主要探讨内容及结论如下：第一部分：HBV/preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达。根据外膜蛋白的跨膜特性将大外膜蛋白人为地分为6段并设计了6对引物，经PCR扩增后，分别使扩增产物在前S1、前S2编码区的5’端加入尿激酶原的信号肽序列、6*组氨酸（HIS），3’端加入HA标签的编码序列和EGFP片段。这6段扩增产物含有跨膜区的编码序列。由于HBV前S1的氨基端锚定于细胞膜上，本实验设计PCR扩增产物不含有前S1蛋白氨基端前11个氨基酸的编码区。构建好的载体转染人肾上皮293细胞，以观察绿色荧光，Westernblotting及激光共聚焦等策略检测蛋白在细胞内外的表达情况。最后获得了可以较高表达目的蛋白的HBV/（preS1-preS2-HBsAg）pcDNA3.1/293细胞株，为下一步探讨治疗性疫苗的探讨提供了参考。第二部分：HBV/(preS1-preS2-FC)、HBV/(preS1-FC)真核表达载体的构建及在293细胞中的表达和纯化。根据第一部分的提示和结果设定采取重叠延伸PCR策略连接信号肽与各目的基因，将编码乙肝病毒S1抗原、S2抗原和连接入含有人IgG1Fc段的pcDNA3.1表达载体。其中加入人IgG1Fc段可以提升免疫原性，应对目前乙肝疫苗有着的抗体应答水平和免疫保护率不高等不足。采取阳离子脂质体法转染293细胞，经G418加压筛选阳性克隆。最后获得了可以较高表达目的蛋白的HBV/preS1-preS2-Fc、HBV/(preS1-FC)pcDNA3.1/293细胞株。关键词：乙型肝炎论文表面抗原论文疫苗论文共表达蛋白论文融合蛋白论文抗体论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要2-4
ABSTRACT4-9
第1章 文献综述9-17

1.1 HBV 的基因结构9

1.2论文导读：学相关操作34-383.3.1基因片段的合成34-353.3.2DNA目的片段的回收35-363.3.3目的片段的双酶切363.3.4目的片段与载体的连接363.3.5转化感受态细胞36-373.3.6挑选阳性克隆并鉴定373.3.7质粒的小量提取37-383.4细胞生物学相关操作内容383.5有关高效表达单克隆细胞株的筛选38-423.

5.1抗生素的加压筛选38-393.2高效

HBV 前 S2 蛋白的生物学功能9-10

1.3 HBV 的复制功能10

1.4 HBV 与机体免疫应答的相关性10-11

1.5 有关 HBV 的临床探讨11-12

1.5.1 前 S2 蛋白与金属硫蛋白的相互作用11

1.5.2 基因表达谱芯片技术的作用11-12

1.5.3 HBV 中前 S2 蛋白与 HBeAg 的相互作用12

1.5.4 前 S2 蛋白与乙型肝炎疫苗的联系12

1.6 HBV 疫苗的探讨近况12-14

1.7 乙肝疫苗的种类14-15

1.8 本课题的探讨内容及作用15-17

第2章 HBV/preS1-preS2-HBsAg 真核表达载体的构建及在 293 细胞中的表达17-33

2.1 材料17-19

2.

1.1 菌株、质粒17

2.

1.2 实验试剂17-18

2.

1.3 仪器设备18-19

2.2 策略19-26

2.1 引物设计与合成19-20

2.2 基因片段的合成20-21

2.3 琼脂糖凝胶 DNA 目的片段的回收21-22

2.4 目的片段与载体的双酶切22-23

2.5 目的片段与载体的连接23

2.6 转化感受态细胞23

2.7 挑选阳性克隆并鉴定23-24

2.8 质粒的小量提取24

2.9 细胞生物学相关操作24-25

2.10 抗生素的加压筛选25

2.11 单克隆细胞筛选25-26

2.12 高表达细胞株的形成26

2.13 重组载体质粒在 293 细胞膜蛋白的定位26

2.3 结果26-32

2.3.1 Pro-UK-6*His-preS1-preS2-HBsAg(1-6)-HA 基因扩增的 PCR 结果26-27

2.3.2 酶切鉴定的结果27-28

2.3.3 测序结果28

2.3.4 稳定表达载体 pcDNA3.1/Pro-UK-6*His-preS1-preS2-HBsAg(1-6)-HA的构建示意图28-29

2.3.5 细胞转染荧光的检测29-30

2.3.6 蛋白质免疫印迹的结果30-31

2.3.7 重组载体质粒在 293 细胞膜蛋白的定位31-32

2.4 讨论32

2.5 小结32-33

第3章 HBV/(preS1-preS2-FC)真核表达载体的构建及在 CHO-K1 细胞中的表达与纯化33-49

3.1 材料33

3.

1.1 质粒、菌株33

3.

1.2 实验试剂33

3.

1.3 仪器设备33

3.2 策略33-34
3.

2.1 引物设计与合成33-34

3.3 分子生物学相关操作34-38

3.1 基因片段的合成34-35

3.2 DNA 目的片段的回收35-36

3.3 目的片段的双酶切36

3.4 目的片段与载体的连接36

3.5 转化感受态细胞36-37

3.6 挑选阳性克隆并鉴定37

3.7 质粒的小量提取37-38

3.4 细胞生物学相关操作内容38

3.5 有关高效表达单克隆细胞株的筛选38-42

3.5.1 抗生素的加压筛选38-39

3.5.2 高效表达细胞株无血清转瓶培养39

3.5.3 亲和层析法纯化目的蛋白39

3.5.4 目的蛋白的浓度和纯度鉴定39-40

3.5.5 蛋白质免疫印迹法鉴定40-42

3.6 结果42-46

3.6.1 重组载体 pcDNA3.1/preS1-preS2-FC 的 PCR 结果42
3.6.2 重组载体 pcDNA3.1/preS1-preS2-a`-FC 的酶切鉴定42-43
3.6.3 重组载体 pcDNA3.1/preS1-preS2-a`-FC 的测序结果43

3.6.4 最终构建好的载体图43

3.6.5 蛋白质免疫印记的结果43-44

3.6.6 细胞转染后的检测44-45

3.6.7 亲和层系纯化结果、蛋白峰45-46

3.7 讨论46-48

3.8 小结48-49

第4章 结论49-50
参考文献50-55
缩略语词汇表55-57
附录 A HBV/preS1-preS2-HBsAg 序列设计57-61
附录 B 表达载体序列测定的结果61-64
附录 C HBV/(preS1-preS2-FC)序列设计64-65
附录 D 重组载体 pcDNA

3.1/preS1-preS2-a`-FC 的测序结果65-67

附录 E HBV/(preS1-preS2-FC)蛋白样品等电点检测图67-68
致谢68-69
攻读硕士学位期间的探讨成果69