简析酪氨酸逍遥散对慢性轻度不可预知应激诱导肝郁证大鼠模型影响

论文导读：
摘要：1.探讨背景随着现代生活节奏的加速,工作的压力、社会的竞争、起居调摄失宜等理由,可造成人们心理负荷加重,情志抑郁,气机失于调达,而致肝气郁滞。在现代临床各种疾病中有肝郁证体现者具有普遍现象,随着生物—心理—社会医学方式的建立,肝郁证在各种疾病的发生进展中起着重要的作用,由此对于肝郁证的探讨也得到了进一步的关注众多学者多年的探讨和探讨成果认为肝郁证和应激密切相关,并且涉及机体神经、内分泌、循环、消化、免疫等多个系统。对应激所涉及的下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统(HPA)、蓝斑-交感-肾上腺髓质系统(LC-NE)等系统国外均探讨相对较为全面。在我国,对于肝郁证的探讨近几年主要集中在神经内分泌系统的探讨上,但是多关注在HPA轴、下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPTA)或是下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)上,对LC-NE的探讨仍然少见。由此,本课题组拟以LC-NE轴为主以行为学、蛋白质组学方面探讨慢性束缚应激对肝郁模型大鼠LC-NE系统的影响及逍遥散的干预作用,希望能进一步揭示肝郁证的本质。以目前公开发表的文献看,大多数现代医家将抑郁症与肝郁证直接对应,认为抑郁证是一种情绪障碍性疾病,体现为一种持久的抑郁状态,伴有情绪低落,躯体不适和睡眠障碍等症。属于中医学“郁病”范畴。抑郁症的发病机制很复杂,目前尚未完全阐明,概括的说是生物、心理、社会(文化)因素相互作用的结果。关于抑郁症发病的神经生化机制的假说较多,儿茶酚胺(儿茶酚胺包括多巴胺、肾上腺素及去甲肾上腺素)是较为公认的假说之一：即抑郁症的发生是脑中儿茶酚胺NE、DA、E等兴奋性神经递质功能低下所致,这个假说得到了许多探讨的证实。儿茶酚胺是一种重要的中枢内源性神经递质,对内脏伤害性信息传入具有抑制性调控作用。TH是儿茶酚胺生物合成的限速酶,是全部儿茶酚胺类代谢的限速环节。蓝斑位于脑内去甲肾上腺素神经元胞体背束起源处,纤维广泛地分布于大脑及小脑皮质、海马、杏仁核、下丘脑前区。蓝斑—去甲肾上腺素能系统与情感、行为、状态依赖的认知历程及意识状态有关,参与醒觉及注意功能。慢性应激、蓝斑功能与抑郁症联系密切：蓝斑-肾上腺神经递质的下调与一些精神疾病,如应激后情感障碍、睡眠和醒觉障碍密切相关；反复或延长的应激原引起蓝斑-去甲肾上腺素系统的转变,可引起蓝斑损害。2.目的与作用观察逍遥散对慢性轻度不可预知应激诱导的肝郁证模型大鼠行为学及蓝斑中论文导读：05表示统计学上有作用。5.结果5.1行为学：与正常组比较,模型组大鼠在敞箱里面的爬格数和直立次数显著减少,差别具有统计学作用(P0.05)；逍遥散及氟西汀连续给药后大鼠的直立次数上一页1234下一页
酪氨酸羟化酶表达水平的影响,探讨逍遥散能否通过调节酪氨酸羟化酶的表达水平而防治肝郁证。3.探讨策略SD雄性大鼠360只,随机分为5个时间段：1天组、3天组、7天组、14天组、21天组,每个时间段72只大鼠。大鼠随机分为A组、B组、C组、D组,运用慢性轻度不可预见性应激配合孤养复制肝郁模型。(正常对照组(A组)、肝郁证模型组(B组)、肝郁证逍遥散组(C组)、肝郁证氟西汀组(D组),每组各18只。)孤养基础上每日再随机选用其他一到两种刺激方式。根据大鼠个体体重每日下午16时给大鼠经胃灌相应药量：C组大鼠予逍遥散灌胃10g/kg.d,D组大鼠以氟西汀灌胃5mg/kg.d,A、B组大鼠同时以生理盐水灌胃。造模、治疗结束后,处死动物,取血、取脑脊液及下丘脑、海马、蓝斑、甲状腺、肾上腺、肝脏等组织备用。一部分用于免疫组化用,一部分用于免疫印迹用,还有一部分用于逆转录-实时定量聚合酶链式反应。(为本课题组后期蛋白组学探讨妥善保存好各标本)4.探讨内容4.1行为学：在造模前后上午8时开始置大鼠于测试实验室内适应10mmin,确保在安静、四周由全封闭的遮光帘隔离干扰的环境条件下进行。操作者握住大鼠尾根部1/3处,轻轻将大鼠放入旷场箱的区内,开始同步录像、计时。观察5min内大鼠的穿越格数(四爪均进入的方格方可计数)、直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁)。三位观察者观看录像评分,计算机浅析系统浅析大鼠的运动轨迹；4.2液体消耗量：造模、治疗前后双瓶训练48小时,禁食禁水23小时,测1小时的糖水摄取量；(其中一瓶是1%蔗糖水,一瓶是纯水)4.3体重变化：造模、治疗前后各测量大鼠体重1次；4.4形态学：HE染色观察蓝斑神经元形态,尼氏染色观察尼氏体形态及数量的转变；4.5免疫组织化学法：采取免疫组化SABC法检测14天组大鼠蓝斑中酪氨酸羟化酶的表达；4.6Western blot:采取免疫印迹法检测14天组大鼠蓝斑酪氨酸羟化酶蛋白表达情况；4.7RT-PCR：采取逆转录聚合酶链反应策略检测14天组大鼠蓝斑酪氨酸羟化酶基因表达水平变化；4.8统计学：数据以x±s表示,采取SPSS16.0软件包进行统计浅析,以P0.05表示统计学上有作用。5.结果5.1行为学：与正常组比较,模型组大鼠在敞箱里面的爬格数和直立次数显著减少,差别具有统计学作用(P0.05)；逍遥散及氟西汀连续给药后大鼠的直立次数论文导读：模型组增加,具有显著性差别(P0.05)。1天组和3天组逍遥散组、氟西汀组大鼠爬格和直立次数较模型组增加不显著,无显著性差别(P0.05)；5.2液体消耗量：与正常组比较,模型组大鼠糖水消耗量显著减少,差别具有统计学作用(P0.05)；逍遥散及氟西汀连续给药后大鼠的糖水消耗量均有升高,7天组、14天组、21天组逍遥散组、氟西汀组大鼠糖水消
和爬格次数均有升高,7天组、14天组、21天组逍遥散组、氟西汀组大鼠爬格和直立次数较模型组增加,具有显著性差别(P0.05)。1天组和3天组逍遥散组、氟西汀组大鼠爬格和直立次数较模型组增加不显著,无显著性差别(P0.05)；5.2液体消耗量：与正常组比较,模型组大鼠糖水消耗量显著减少,差别具有统计学作用(P0.05)；逍遥散及氟西汀连续给药后大鼠的糖水消耗量均有升高,7天组、14天组、21天组逍遥散组、氟西汀组大鼠糖水消耗量较模型组增加显著,具有显著性差别(P0.05)。3天组大鼠糖水消耗量变化不显著,无统计学作用(P0.05)；5.3体重变化：1天组、3天组大鼠体重变化不显著,无统计学作用；7天组、14天组、21天组,造模后大鼠体重显著下降,模型组与正常组比较,差别具有统计学作用(P0.05)；7天组、14天组、21天组中逍遥散组及氟西汀组与模型组比较体重显著增加,差别有统计学作用(P0.05)；5.4形态学：蓝斑HE染色结果可见其位于第四脑室底与侧脑室的交界处,其神经元的细胞形态都比较大,细胞排列紧密,胞体呈圆形、梭形或不规则形,胞核居中,核大而圆,向周围伸出较长的突起。经慢性应激后大鼠蓝斑神经细胞肿胀、固缩,逍遥散及氟西汀连续给药组,神经元结构大部分恢复正常,且逍遥散的这种作用更显著；5.5免疫组化：免疫组化法检测LC中TH的表达变化,发现经慢性不可预知应激后模型组TH的阳性细胞数目小于正常组(P0.05)。经逍遥散及氟西汀干预的逍遥散组、氟西汀组TH的表达有上调的走势；5.6Western blot：运用蛋白免疫印迹技术检测肝郁组LC中TH蛋白的表达,结果提示较正常组下调；逍遥散组及氟西汀组TH的蛋白表达大于肝郁组,差别有统计学作用(P0.05)；5.7RT-PCR:应激使肝郁大鼠中枢TH基因表达较正常组减弱,逍遥散及氟西汀使TH mRNA表达上调,与肝郁组比较,具有显著性差别(P0.05)。6.结论6.1借鉴国内外慢性不可预知应激复制抑郁症模型的策略,利用多种不同应激条件随机组合起来的慢性应激历程,可以导致大鼠产生抑郁样行为,造模时间越长,大鼠的抑郁样行为体现越显著；我们成功的复制大鼠的肝郁证模型；6.2“肝郁证”模型大鼠体现为懒动倦怠,反应迟钝,安静喜卧,贴壁蜷缩等症状,糖水消耗、摄食、运动评分(敞箱实验)减少,逍遥散能够在一定程度上改善大鼠的行为学变化论文导读：
,表明逍遥散能够有效干预大鼠的“肝郁证”。且与干预时间长短有一定联系：1、3天组作用不显著,7、14、21天组作用显著；6.3慢性轻度不可预知应激导致大鼠脑内神经元结构异常及神经细胞数量减少,TH的蛋白及基因表达水平下调；逍遥散和氟西汀能改善因应激导致的蓝斑神经元结构的损伤,提升应激大鼠蓝斑TH的蛋白及基因表达水平,这可能是逍遥散抗抑郁的机制之一。关键词：肝郁证论文慢性应激束缚论文行为学论文酪氨酸羟化酶论文逍遥散论文氟西汀论文
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ABSTRACT8-14
前言14-16
第一章 文献探讨16-22

1. 中医对肝郁证的认识16-18

2. 现代探讨进展18-22

第二章 实验探讨22-45
第一节 肝郁模型的复制及行为学的观察22-30

一、材料22-23

二、实验内容与策略23-26

三、结果26-29

四、讨论29-30

第二节 肝郁模型大鼠蓝斑酪氨酸羟化酶的表达变化30-45

一、材料30-34

二、实验内容与策略34-39

三、结果39-43

四、讨论43-45

全文小结45-46
参考文献46-50
附图50-52
缩略词对照表52-53
论文发表情况53-54
致谢54-56
统计学审稿证明56