谈谈克隆E.coliK5合成Heparosan关键酶基因kfic克隆与表达及Heparosan解聚

论文导读：
摘要：肝素作为抗凝血药物在临床医药上具有广泛的运用。Heparosan是某些病原菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，是肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。另一方面，由于普通肝素在实际运用中出现了一些不良的副作用，相较之下低分子量肝素具有副作用低、更可预见的药理作用、半衰期长和更好的生物利用率等优点。由此，低分子量肝素是普通肝素的最佳替代物。本论文进行了E. cop K5中合成heparosan关键酶基因kfic克隆和表达，为构建产heparosan工程菌提供参考。同时进行了几种解聚heparosan策略的比较和优化，为将来用于以低分子量的heparosan合成低分子量肝素打下基础。首先，利用PCR技术成功地以E. cop K5克隆到了产heparosan关键酶基因kfic，并将测序结果于NCBI上进行BLAST比对，获得的KfiC基因与Escherichia cop Genomic Island II, strain Nissle1917的同源性为100%。在成功克隆目的基因kfic的基础上，本论文成功构建重组表达质粒pET28b-kfic，并将其转入到E. cop BL21（DE3）宿主菌中，实现少量的表达但是表达不稳定。考察了分离胶浓度和heparosan上样量对多糖PAGE效果的影响，当分离胶浓度为10%时多糖的分离效果最好；Heparosan粗品的上样量1.5mg， heparosan纯品的上样量1mg以及商品化肝素钠的上样量0.06mg为宜。考察了生物解聚法、化学解聚法和物理解聚法中各因素对heparosan解聚结果的影响。结果表明，肝素酶Ⅱ（HepⅡ）能有效地解聚heparosan，最佳的酶解缓冲液为酶解缓冲液B即100mM乙酸钠、0.01%BSA和10mM乙酸钙，pH7.0；最佳酶用量为19U/mL；最佳酶解反应时间是1.5h。H2O2对heparosan的解聚效果显著，解聚反应的最佳乙酸浓度为4.5%、H2O2浓度为6%、反应温度为55℃和反应时间为5h。超声波法也能解聚heparosan，随着时间的增加，产物的相对分子量逐渐降低；加入NaNO2的超声波解聚较普通超声波解聚效率高，即NaNO2在超声波解聚heparosan的历程中能起到加速heparosan解聚的作用。关键词：E.cop论文K5论文KfiC论文基因克隆论文Heparosan论文解聚论文PAGE论文
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ABSTRACT5-13
第一章 绪论13-31

1.1 肝素介绍13-14

1.2 肝素合成前体介绍14-15

1.3 E. cop K5 及合成 heparosan 关键酶 KfiC 的介绍15-17

1.4 低分子肝素及其制备的探讨进展17-25

1.4.1 化学降解法18-20

1.4.1 亚硝酸解聚法18

1.4.2 碱解聚法18-19

1.4.3 氧化解聚法19

1.4.4 臭氧解聚法19-20

1.4.5 光化学解聚法20

1.4.2 物理法20-21

1.4.3 生物解聚法21-24

1.4.3.1 肝素裂解酶 I22

1.4.3.2 肝素裂解酶 II22

1.4.3.3 肝素裂解酶 III22-23

1.4.3.4 其他裂解酶23-24

1.4.4 合成法24-25

1.5 本论文探讨的主要内容及革新点25-26

1.5.1 本论文探讨的主要内容25-26

1.5.2 本论新点26

参考文献26-31
第二章 E. cop K5 合成heparosan关键酶基因kfic的克隆及序列浅析31-48

2.1 引言31

2.2 材料和策略31-40

2.1 材料31-40

2.2.

1.1 菌株和质粒31-32

2.2.

1.2 培养基与缓冲液32

2.2.

1.3 主要实验仪器32-33

2.2.

1.4 工具酶和试剂33-34

2.2.

1.5 实验策略34

2.2.

1.6 E. cop K5 基因组 DNA 的提取34-35

2.2.

1.7 合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的 PCR 扩增35-36

2.2.

1.8 电泳检测 PCR 产物36-37

2论文导读：
.2.

1.9 合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的克隆37-38

2.2.

1.10 E.cop DH5 感受态细胞的制备38

2.2.

1.11 转化 E.cop DH5 感受态细胞38-39

2.2.

1.12 阳性单克隆筛选39

2.2.

1.13 菌落 PCR39

2.2.

1.14 克隆质粒提取39-40

2.2.

1.15 目的基因测序及其浅析40

2.3 结果与讨论40-46

2.3.1 目的基因 PCR 扩增40-41

2.3.2 合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的克隆41-43

2.3.3 合成 heparosan 关键酶基因 kfic 的序列浅析43-46

2.4 小结46-47

参考文献47-48
第三章 合成heparosan关键酶基因kfic在E. cop BL21(DE3)中的表达及诱导条件优化48-62

3.1 引言48-49

3.2 材料和策略49-55

3.

2.1 实验菌株和质粒49

3.

2.2 培养基、工具酶及试剂49-51

3.

2.3 实验仪器51

3.

2.4 实验策略51-55

3.

2.4.1 引物设计51-52

3.

2.4.2 质粒提取52

3.

2.4.3 目的基因与表达载体的双酶切52

3.

2.4.4 重组表达质粒 pET28b-kfic 的构建52-53

3.

2.4.5 感受态细胞的制备与转化53

3.

2.4.6 阳性单克隆的筛选53

3.

2.4.7 重组蛋白的诱导表达53-54

3.

2.4.8 蛋白的 SDS-PAGE 浅析54-55

3.3 结果与讨论55-60

3.1 重组表达质粒的构建55-56

3.2 重组表达质粒的 PCR 鉴定56-57

3.3 重组表达质粒的酶切鉴定57-58

3.4 重组蛋白的表达及其表达条件优化58-60

3.4.1 诱导剂（IPTG）剂量对重组蛋白表达的影响58-59

3.4.2 诱导时间对重组蛋白诱导表达的影响59-60

3.4 本章小结60-61

参考文献61-62
第四章 Heparosan不同解聚策略及条件的探讨62-87

4.1 前言62-63

4.2 材料与策略63-66

4.

2.1 实验材料63-64

4.2.

1.1 实验样品63

4.2.

1.2 实验试剂及其配制63-64

4.2.

1.3 实验仪器64

4.2.2 实验策略64-66
4.

2.1 亚硝酸解聚 heparosan 策略64

4.

2.2 H2O2解聚 heparosan 策略64

4.

2.3 肝素酶Ⅱ解聚 heparosan 策略64

4.

2.4 超声波解聚 heparosan 策略64-65

4.

2.5 加入亚硝酸钠的超声波解聚 heparosan 策略65

4.

2.6 电泳样品处理65

4.

2.7 Heparosan 的分离纯化65

4.

2.8 多糖的 PAGE65-66

4.3 结果与讨论66-83
4.

3.1 PAGE 的条件优化66-68

4.3.

1.1 多糖 PAGE 分离胶浓度的选择66-67

4.3.

1.2 多糖上样量的选择67-68

4.3.2 肝素酶Ⅱ（HeparinaseⅡ）解聚 heparosan 的探讨68-72
4.3.

2.1 酶解缓冲液对 heparosan 解聚的影响68-70

4.3.

2.2 Hep II 加入量对 heparosan 解聚的影响70

4.3.

2.3 酶解反应时间对 heparosan 解聚的影响70-71

4.3.

2.4 Hep II 酶解 heparosan 产物的1H-NMR 浅析71-72

4.3.3 H2O2解聚 heparosan 的探讨72-77
4.

3.1 乙酸浓度对 heparosan 解聚的影响72

4.

3.2 H2O2浓度对 heparosan 解聚的影响72-73

4.

3.3 反应温度对 heparosan 解聚的影响73-75

4.

3.4 反应时间对 heparosan 解聚的影响75-76

4.

3.5 H2O2解聚 heparosan 产物的1H-NMR 浅析76-77

4.

3.4 亚硝酸钠解聚 heparosan 的探讨77-81

4.

3.4.1 乙酸浓度对 heparosan 解聚的影响78

4.

3.4.2 NaNO2浓度对 heparosan 解聚的影响78-80

4.

3.4.3 反应温度对 heparosan 解聚的影响80

4.3.4.4论文导读：.5.2亚硝酸钠对heparosan超声波解聚的影响82-834.4本章小结83-84参考文献84-87第五章结论与展望87-905.1结论87-885.2展望88-90致谢90-91攻读硕士学位期间发表的论文91上一页123
反应时间对 heparosan 解聚的影响80-81
4.

3.5 超声波法解聚 heparosan 的探讨81-83

4.

3.5.1 超声时间对 heparosan 解聚的影响81-82

4.

3.5.2 亚硝酸钠对 heparosan 超声波解聚的影响82-83

4.4 本章小结83-84
参考文献84-87
第五章 结论与展望87-90

5.1 结论87-88

5.2 展望88-90

致谢90-91
攻读硕士学位期间发表的论文91