试议马铃薯马铃薯多酚类化合物对结肠癌和肝癌细胞增殖影响及花色苷生物合成关键酶基因如何

论文导读：
摘要：植物多酚(plant polyphenols)是多羟基酚类化合物的总称。植物多酚类化合物在体外有较强的抗氧化作用,并且具有天然、高效、低毒等优点。由此,近年来有关多酚类化合物的生化与分子生物学探讨,引起了全世界科学家的广泛关注和浓厚兴趣,并将成为今后开发天然抗氧化剂的主要方向。马铃薯含有大量的抗氧化活性物质,包括多酚,维他命c和类胡萝卜素,其中彩色马铃薯块茎中的抗氧化剂含量较高,主要成分是花色苷。探讨马铃薯多酚类化合物体外抗癌效应及作用机制、阐明不同马铃薯品种中花色苷生物合成的分子基础,可以为进一步利用马铃薯色素开发天然抗氧化剂以及彩色马铃薯研制提供论述和实践依据,具有十分重要的探讨价值。本探讨以不同颜色的马铃薯(Solarium tuberosum)品种为材料,通过测定抗氧化活性、总酚含量、绿原酸含量、花色素含量和体外抑制癌细胞增殖效应,浅析马铃薯多酚类化合物的抗癌活性与作用机制；通过同源克隆策略,克隆了马铃薯花色苷合成关键酶基因CHI,并对不同马铃薯品种花色苷生物合成关键基因的结构和表达差别进行了浅析；进一步选取花色苷合成关键酶基因3GT遗传转化白皮马铃薯品种。探讨结果如下：1.马铃薯多酚类化合物的抗氧化活性。采取了两种不同有机溶剂提取策略,得到四个马铃薯栽培品种和一个马铃薯野生种总酚提取物,分别测定了其抗氧化活性、总酚含量、绿原酸含量和花色素含量,结果表明,(1)马铃薯野生种S. pinnatisectum抗氧化活性、总酚含量和绿原酸含量最高,其次为紫薯'Purple Majesty'、'Bora Valley'和'Mountain Rose',白薯'Northstar'最低,同时彩色薯的花色素含量高于白薯；(2)抗氧化活性与总酚、绿原酸和花色素含量之间有着极显著的正相关性；(3)两种不同有机溶剂提取策略分别得到溶液状和粉末状马铃薯提取物,对其进行总酚含量和抗氧化活性测定后得到的结论是一致的。2.马铃薯多酚提取物对人体结肠癌Caco-2细胞和肝癌HepG2细胞体外增殖的抑制效应。分别采取形态学观察和XTT比色法检测了四个马铃薯栽培品种和一个野生种的多酚提取物以及三种马铃薯块茎含有的酚类标准物对癌细胞增殖的影响,结果表明,(1)马铃薯多酚类化合物显著抑制癌细胞体外增殖,且浓度越高,增殖率越低,其中野生种S. pinnatisectum抑制癌细胞的效果最论文导读：匍匐茎和根中表达水平较高,在匍匐茎和块茎中表达水平基本相当,也都比较高,在芽和花中有低水平的表达,茎和叶中没有检测到。4.马铃薯花色苷合成途径中关键酶基因的结构和表达浅析。(1)红皮马铃薯栽培品种'Chieftain'和白皮品种'Superior'的叶片基因组DNA中都含有花色苷生物合成的关键酶基因CHS、CHI、F3H、DFR和3GT,将扩增获得
显著,彩色马铃薯栽培品种'Mountain Rose'、'Bora Valley'和'Purple Majesty'比白色品种'Northstar'具有更好的抑制效果；马铃薯多酚含量、抗氧化活性和抗癌活性三者之间有着显著的正相关性；(2)天然多酚类化合物绿原酸和花色素都显著抑制癌细胞的生长,并且浓度越高,增殖率越低,其中绿原酸抑制癌细胞增殖的效果最好,其次为天竺葵素和锦葵素。3.马铃薯花色苷合成关键酶基因CHI的克隆与表达浅析。(1)采取RT-PCR的策略在马铃薯野生种S. pinnatisectum中克隆得到查尔酮异构酶基因CHI cDNA和gDNA序列,该基因无内含子,包含一个全长为657bp的开放阅读框,编码一个由218氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白的分子量为24.46kDa,论述等电点为7.68,采取DNAMAN对CHI和其他同源蛋白的氨基酸序列比对,结果表明马铃薯CHI氨基酸序列与茄科植物番茄的同源蛋白序列一致性最高,亲缘联系也最近。(2)采取半定量RT-PCR策略对CHI mRNA水平空间表达浅析显示,该基因在马铃薯的匍匐茎、膨大的匍匐茎、成熟块茎、顶芽、花和根中都有表达,其中在膨大的匍匐茎和根中表达水平较高,在匍匐茎和块茎中表达水平基本相当,也都比较高,在芽和花中有低水平的表达,茎和叶中没有检测到。4.马铃薯花色苷合成途径中关键酶基因的结构和表达浅析。(1)红皮马铃薯栽培品种'Chieftain'和白皮品种'Superior'的叶片基因组DNA中都含有花色苷生物合成的关键酶基因CHS、CHI、F3H、DFR和3GT,将扩增获得的gDNA序列和GenBank中相应的cDNA序列进行比对,结果显示,CHI和3GT基因不含有内含子,CHS含有一个内含子和两个外显子,F3H基因含有两个内含子和三个外显子,DFR基因含有五个内含子和六个外显子；(2) CHS. CHI、F3H、DFR和3GT在红皮马铃薯栽培品种'Desiree'、'Chieftain'和白皮品种'Superior'中的表达差别浅析显示,除了CHI,其他四个基因在地上部分叶片中都表达；在地下部分的匍匐茎和块茎中,这五个基因都在中表达；而在白薯中,只有最上游的CHS基因在匍匐茎中有所表达,其他基因都没有检测到。由此可见,白薯'Superior'中没有花色苷的合成可能与花色苷生物合成相关基因CHI及论文导读：和溶液的配制492.1.3马铃薯总酚的提取49-502.1.4DPPH法测定马铃薯提取物的抗氧化活性502.1.5Fopn-Ciocalteu比色法测定马铃薯提取物的总酚含量50-512.1.6钼酸钠比色法测定马铃薯提取物的绿原酸含量512.1.7上一页12345下一页
其下游基因的不表达有关。5.通过农杆菌介导的遗传转化将3GT基因导入到白皮马铃薯栽培品种'Superior'中,共得到了18个Kan抗性株系,通过PCR检测,有3株体现为阳性。关键词：马铃薯论文多酚论文花色苷论文抗癌活性论文基因克隆论文遗传转化论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要8-10
ABSTRACT10-13
缩略词表13-14
引言14-16
第一章 文献综述16-48

1.1 植物多酚概述16-26

1.1 植物多酚类化合物的分布16-17

1.2 植物多酚类化合物的化学结构及分类17-19

1.3 植物多酚类化合物的提取策略19-21

1.4 植物多酚类化合物的测定策略21-22

1.5 植物多酚类化合物的生理功能22-24

1.6 植物多酚类化合物的运用近况24-26

1.2 植物多酚的药理作用26-34

1.2.1 抗氧化作用26-30

1.2.2 预防心脑血管疾病作用30-31

1.2.3 抗突变和抗肿瘤、防癌作用31-32

1.2.4 抑菌消炎和抗病毒32-33

1.2.5 调节机体免疫功能作用33

1.2.6 抗辐射作用33

1.2.7 其它药理作用33-34

1.3 植物多酚在医药中的运用34-36

1.3.1 天然抗氧化剂34

1.3.2 治疗心脑血管病药物34

1.3.3 解毒护肝药物34-35

1.3.4 抑菌消炎、抗病物35

1.3.5 保健品类35-36

1.4 植物花色苷基因工程探讨进展36-48

1.4.1 花色苷的生物合成37-42

1.4.2 影响花色苷合成与积累的主要因素42-44

1.4.3 花色苷基因工程改良的基本对策44-45

1.4.4 植物基因工程改良的安全性45-48

第二章 马铃薯块茎中总酚的含量和抗氧化活性浅析48-58

2.1 材料与策略48-52

2.

1.1 植物材料48-49

2.

1.2 主要试剂和溶液的配制49

2.

1.3 马铃薯总酚的提取49-50

2.

1.4 DPPH法测定马铃薯提取物的抗氧化活性50

2.

1.5 Fopn-Ciocalteu比色法测定马铃薯提取物的总酚含量50-51

2.

1.6 钼酸钠比色法测定马铃薯提取物的绿原酸含量51

2.1.7论文导读：2-713.2.1癌细胞生长的形态学观察62-633.2.2马铃薯多酚提取物对癌细胞增殖的影响63-673.2.3马铃薯提取物抑制癌细胞增殖的半数效量与多酚含量和抗氧化活性的相关性浅析67-683.2.4天然多酚类标准物对癌细胞增殖的影响68-713.3讨论71-743.3.1马铃薯多酚提取物对癌细胞增殖的影响71-723.3.2天然多酚类标准物对癌细胞增殖
马铃薯提取物花色素含量的测定51

2.

1.8 统计浅析51-52

2 实验结果52-55

2.1 标准曲线的绘制52-53

2.2 不同品种马铃薯提取物的抗氧化活性及其成分测定浅析53-54

2.2.3 马铃薯提取物的抗氧化活性、总酚含量、绿原酸含量和花色素含量的相关性浅析54-55

2.3 讨论55-58

2.3.1 马铃薯提取物的抗氧化活性和成分测定55-56

2.3.2 马铃薯提取物抗氧化活性与总酚、绿原酸、花色素含量的相关性浅析56

2.3.3 马铃薯多酚类化合物不同提取策略的比较56-58

第三章 马铃薯多酚提取物对人体结肠癌和肝癌细胞增殖的影响58-74

3.1 材料与策略59-62

3.

1.1 植物材料59

3.

1.2 主要仪器59

3.

1.3 主要试剂和溶液的配制59-60

3.

1.4 癌细胞培养60

3.

1.5 XTT比色法检测马铃薯多酚提取物和酚类标准物对癌细胞的毒性60-61

3.

1.6 统计浅析61-62

3.2 实验结果62-71
3.

2.1 癌细胞生长的形态学观察62-63

3.

2.2 马铃薯多酚提取物对癌细胞增殖的影响63-67

3.2.3 马铃薯提取物抑制癌细胞增殖的半数效量与多酚含量和抗氧化活性的相关性浅析67-68
3.

2.4 天然多酚类标准物对癌细胞增殖的影响68-71

3.3 讨论71-74

3.1 马铃薯多酚提取物对癌细胞增殖的影响71-72

3.2 天然多酚类标准物对癌细胞增殖的影响72-74

第四章 马铃薯CHI基因的克隆与表达浅析74-86

4.1 材料与策略74-78

4.

1.1 植物材料74-75

4.

1.2 主要试剂和溶液的配制75

4.

1.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成75

4.

1.4 基因组DNA的提取75-76

4.

1.5 马铃薯野生种CHI cDNA和gDNA的扩增与组织表达浅析76-77

4.

1.6 马铃薯野生种CHI基因的组织表达半定量RT-PCR浅析77

4.

1.7 生物信息学浅析77-78

4.2 实验结果78-83
4.

2.1 CHI基因的克隆与序列浅析78-83

4.

2.2 利用半定量RT-PCR策略浅析CHI基因的组织表达特性83

4.3 讨论83-86
4.

3.1 马铃薯CHI基因的克隆与生物信息学浅析83-84

4.

3.2 马铃薯CHI基因的空间表达方式84-86

第五章 马铃薯栽培种中花色苷生物合成关键酶基因的结构和表达浅析86-94
5论文导读：栽培种花色苷合成关键酶基因gDNA全长的扩增87-885.1.6红色和白色马铃薯栽培种的花色苷合成关键酶基因的表达浅析885.2浅析结果88-925.2.1马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因的结构浅析88-915.2.2白色和红色马铃薯品种中花色苷合成关键酶基因的表达差别浅析91-925.3讨论92-945.

3.1马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因的结构

.1 材料与策略86-88
5.

1.1 植物材料86

5.

1.2 主要试剂和溶液的配制86-87

5.

1.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成87

5.

1.4 基因组DNA的提取87

5.

1.5 马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因gDNA全长的扩增87-88

5.

1.6 红色和白色马铃薯栽培种的花色苷合成关键酶基因的表达浅析88

5.2 浅析结果88-92
5.

2.1 马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因的结构浅析88-91

5.

2.2 白色和红色马铃薯品种中花色苷合成关键酶基因的表达差别浅析91-92

5.3 讨论92-94
5.

3.1 马铃薯栽培种花色苷合成关键酶基因的结构浅析92

5.

3.2 马铃薯栽培种中花色苷合成关键酶基因的表达差别浅析92-94

第六章 马铃薯3GT基因的遗传转化94-102

6.1 实验材料94-95

6.

1.1 供试材料94-95

6.

1.2 菌株与质粒95

6.

1.3 主要培养基的配制95

6.2 实验策略95-97
6.

2.1 pBin19/G-3GT的农杆菌转化95-96

6.

2.2 菌液制备96

6.

2.3 遗传转化96

6.

2.4 Kan选择压的筛选96

6.

2.5 再生植株的抗性筛选96-97

6.

2.6 转基因马铃薯的PCR检测97

6.3 实验结果97-99
6.

3.1 农杆菌转化及质粒检测97-98

6.

3.2 Kan选择压的确定98

6.

3.3 转基因马铃薯植株再生98-99

6.

3.4 转基因植株的PCR检测99

6.4 讨论99-102
全文结论102-104
本探讨的革新点104-106
参考文献106-124
附录124-130
攻读博士学位期间发表的探讨论文130-132
致谢132