简论激酶纳米材料信号增强电化学/电化学发光检测蛋白激酶

论文导读：
摘要：蛋白质磷酸化在新陈代谢、细胞信号通讯、细胞增殖与分化等生命活动中起着非常重要的作用。据统计，有高达30%的人类蛋白要经过蛋白激酶的修饰，以而调节细胞的生理生化功能。而异常的蛋白质磷酸化与许多疾病密切相关，如许多慢性炎症性疾病、癌症、糖尿病和老年性痴呆等。由此，了解蛋白激酶的作用机理并找出有潜在功能的抑制剂，对疾病的诊断、治疗和药物的研发具有非常重要的指导作用。传统的蛋白激酶活性检测策略有很多，尽管这些策略很有效，但大多具有操作复杂、灵敏度不高、需放射性标记、需昂贵仪器等缺点，所以进展新的蛋白激酶活性浅析策略是十分必要的。电化学和电化学发光生物传感器具有装置简单、灵敏度高、选择性好等特点而受到探讨者们的广泛关注。特别是随着纳米技术的进展，各种功能化纳米材料被逐渐引入电化学及电化学发光生物传感器的构建。由于纳米材料本身所具备的小尺寸效应、大比表面积、良好的生物相容性和表面易修饰等优良特性，尤其是在检测DNA、蛋白质、小分子等方面所体现出的信号增强效应，为电化学及电化学发光生物传感器性能的进一步改善和优化带来了新契机。基于此，本论文以进展蛋白激酶浅析新策略为目标，利用纳米材料信号增强作用，构建新型电化学和电化学发光生物传感器，开展了蛋白激酶活性及其抑制剂相关探讨，主要包括以下两个方面的工作：一、基于TiO_2/MWNTs纳米复合物免标记电化学检测酪蛋白激酶2活性利用TiO_2/MWNTs纳米复合物进展了一种免标记浅析酪蛋白激酶2（CK2）活性以及相关抑制剂的电化学策略。该策略利用TiO_2纳米颗粒能特异性结合磷酸基团和MWNTs能加速电子传递速率的特性来实现CK2活性的灵敏检测。首先将合成的TiO_2/MWNTs纳米复合物修饰在玻碳电极表面，其中MWNTs既可以增加电极的比表面积，还可以加速电子传递。在ATP有着的条件下，CK2催化底物肽磷酸化，将磷酸基团转移到底物肽的丝氨酸残基上。由于磷酸基团能与TiO_2纳米颗粒特异性结合，使磷酸化的底物肽结合到被TiO_2/MWNTs纳米复合物质修饰的玻碳电极表面，形成肽绝缘层。在电极表面形成的肽绝缘层使氧化还原探针[Fe(CN)6]3/4不易靠近电极表面以而使峰电流下降，下降的峰电流大小与CK2浓度成响应联系，这提供了一种新型传感对策来监控底物肽的磷酸化。该设计能实现CK2活性的免标记浅析，得到的检测限为0.07U/mL，线性响应浓度范围为0U/mL~0.5U/mL。同时，该策略还被用于对CK2的抑制实验和干扰实验探讨。二、基于磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒信号增强电化学发光检测蛋白激酶A活性结合磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒（Rubpy-PSiNPs）的信号产生和增强作用，进展了一种免标记且高灵敏浅析蛋白激酶A（PKA）活性和抑制剂的电化学发光策略。首先通过溶胶-凝胶法合成了Rubpy-PSiNPs。当ATP有着时，修饰在金电极上的底物肽经PKA催化将磷酸基团引入到底物肽的丝氨酸残基上。由于Zr~(4+)能与两个磷酸基团共价结合，以而介导磷酸化底物肽与Rubpy-PSiNPs之间的连接，使Rubpy-PSiNPs结合到金电极表面，产生强的电化学发光响应，响应强度与PKA浓度正相关，这提供了一种浅析底物肽磷酸化的传感新对策。该策略能实现对PKA活性高灵敏地浅析，得到的检测限为0.005U/mL，线性浓度响应范围为0.01U/mL~1U/mL。同时，该策略还可用于对PKA的抑制实验和干扰实验探讨。关键词：酪蛋白激酶2论文电化学论文TiO_2/MWNTs论文蛋白激酶A论文电化学发光论文磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒论文
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Abstract7-12
本论文常用英文缩略词表12-13
第1章 绪论13-30

1.1 蛋白激酶的生物学作用及传统检测策略13-16

1.1 蛋白激酶的生物学作用13-15

1.2 蛋白激酶的传统检测策略15-16

1.2 电化学生物传感器16-20

1.2.1 电化学生物传感器概述16-17

1.2.2 电化学生物传感器的分类17-19

1.2.3 电化学检测论文导读：

蛋白激酶活性19-20

1.3 电化学发光生物传感器20-22

1.3.1 电化学发光生物传感器概述20

1.3.2 电化学发光生物传感器的分类20-22

1.3.3 电化学发光检测蛋白激酶活性22

1.4 纳米材料及其在电化学和电化学发光生物传感器中的运用22-28

1.4.1 纳米材料的特性22-23

1.4.2 纳米材料在电化学和电化学发光生物传感器中的运用23-28

1.5 本论文的工作设想28-30

第2章 基于 TIO_2/MWNTS 纳米复合物免标记电化学检测酪蛋白激酶 2 活性30-43

2.1 前言30-31

2.2 实验部分31-34

2.1 试剂和材料31-33

2.2 TiO_2/MWNTs 纳米复合物的合成33

2.3 TiO_2/MWNTs 纳米复合物修饰玻碳电极的构建33

2.4 CK2 活性的电化学检测33-34

2.5 干扰实验的考察34

2.6 抑制剂对 CK2 活性影响的考察34

2.7 稳定性的考察34

2.3 结果与讨论34-42

2.3.1 实验原理34-35

2.3.2 TiO_2/MWNTs 纳米复合物的表征35-36

2.3.3 电极修饰历程的阻抗表征36-37

2.3.4 实验可行性的验证37-38

2.3.5 实验条件的优化38-40

2.3.6 CK2 活性的浅析40

2.3.7 干扰实验的考察40-41

2.3.8 抑制剂的影响41

2.3.9 稳定性的探讨41-42

2.4 小结42-43

第3章 基于磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒信号增强电化学发光检测蛋白激酶 A 活性43-55

3.1 前言43-44

3.2 实验部分44-47

3.

2.1 试剂和材料44-45

3.

2.2 磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒的制备45-46

3.

2.3 工作电极的修饰46

3.

2.4 电化学发光浅析 PKA 活性46-47

3.

2.5 干扰实验的考察47

3.

2.6 抑制剂对 PKA 活性影响的考察47

3.3 结果与讨论47-54

3.1 实验原理47-48

3.2 磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒的表征48-49

3.3 电极修饰历程的阻抗表征49-50

3.4 实验可行性的验证50

3.5 实验条件的优化50-52

3.6 PKA 活性的浅析52

3.7 干扰实验的考察52-53

3.8 抑制剂的影响53-54

3.4 小结54-55

结论55-56
参考文献56-67
致谢67-68
附录 攻读硕士学位期间主要完成的学术论文68