浅论大分子基于量子点核酸和蛋白质新技术

论文导读：
摘要：生命组织、细菌、病毒和病菌均具有独特的核酸序列,这些特定序列的检测在卫生防疫、医学诊断、药物探讨、环境科学及生物工程等领域起着重要作用。另外,生物样品中某些蛋白质浓度异常也是疾病发生的征兆,由此建立快速、准确的生物大分子的浅析策略十分必要。迄今为止检测生物大分子的浅析策略已有许多报道,其中,荧光浅析法以其操作简单、无需底物和灵敏度高等优势,运用最为广泛。荧光浅析法中常用到的荧光标记物包括有机荧光染料和新近进展的荧光纳米粒子,这其中量子点的运用进展非常迅速。相对于传统的有机染料,量子点具有一些优异的特性,使其在核酸和蛋白的浅析检测中常被用作荧光探针。鉴于目前生物大分子检测的探讨近况,偶合量子点优异的荧光特性,本论文进展了多种高灵敏度、高选择性的生物大分子检测新策略,主要探讨内容分为三个部分：1本部分实验进展了一种新颖的链式杂交反应方式,即以捕获探针为循环杂交反应的触发器,报告探针和目标序列之间交替互补,随后结合量子点,实现了单组分DNA的高灵敏度检测。本实验中采取报告探针分别结合捕获探针和目标序列的方式,将捕获探针和报告探针进行了特殊设计,在报告探针和目标序列、捕获探针杂交后,目标序列一端会裸露部分与捕获探针相同的碱基,以而使其它的报告探针会继续与之杂交,而系统中另外的目标序列也会再与报告探针杂交,以此循环,形成高分子量的DNA双链聚合体,建立了信号放大方式。此策略在检测DNA分子方面具有优异的性能,灵敏度高(10fM),对碱基的错配、空缺和插入的识别能力强。在建立了链式杂交反应结合量子点检测特定序列DNA的策略后,第二节进一步将此技术拓展到蛋白质的检测。实验采取环状DNA分子作为循环杂交底物,结合适配体识别技术,建立了检测血小板衍生生长因子PDGF-BB的新策略。PDGF-BB是血清中由多种细胞所产生的能刺激平滑肌细胞、胶质等细胞增生的一种多肽,具有广泛的生理活性。PDGF-BB作为PDGF的重要亚型之一,近年来探讨发现其含量对细胞转化和肿瘤生长有直接的影响,故对PDGF-BB的检测在生物学上有重要的作用。实验设计系统中两个有着互补碱基的生物素化发卡DNA分子由于其自身环的“锁”功能,不能进行杂交；而引入适配体后,与其中一条DNA分子杂交,并将其开环成为直链,引发两个DNA分子之间循环杂交。在此实验中,每个适配体分子会触发一个链式杂交反应,使大量的生物素化的DNA分子凝聚在一起,结合链霉亲和素量子点形成适配体-量子点复合物。随后将适配体-量子点复合物加入到已结合有抗原的微孔中,适配体与抗原结合,通过检测量子点的荧光强度即可确定蛋白质的含量。与非HCR方式相比,该策略信号放大效果显著,灵敏度显著提升,选择性好,并可对真实样品进行快速准确地测定。与传统的ELISA法相比,该策略更为简便可控,原材料更加稳定。2在以上单组分DNA和蛋白质检测的基础上,进一步将策略拓展至双组分的同时测定。实验采取量子点标记寡核苷酸解链温度增强的原理,实现了双组分小RNA分子的测定。实验中对捕获探针、报告探针和目标序列在不同的结合方式下温度的影响进行了考察,结果表明在报告探针先与量子点结合后,再与目标序列和捕获探针杂交时可达到与连接酶有着时同样的效果,即增强了双链DNA的稳定性,解链温度得到提升。选择两个不同粒径的量子点标记对应的报告探针,仅需一步杂交反应即可将系统中三个部分DNA、RNA和量子点结合,无需酶的利用即可对多个组分进行同时测定,并为短链核酸的浅析提供了新的思路。为了进一步提升检测灵敏度,将层层组装的概念引入,以聚苯乙烯微球为核心,利用链霉亲和素和生物素的高度亲和性将量子点层层组装至微球表面,最后结合可与目标序列杂交的报告探针,建立了一个目标分子对应多个荧光标记物的信号放大方式。基于量子点激发光谱宽、发射光谱窄的特性,选用了两个不同发射波长的量子点,利用同一激发波长即可对双组分DNA(HIV-1,HIV-2)进行高灵敏度的检测。与未放大的策略比较,此策略灵敏度提升了100倍。3在荧光共振能量转移系统中,为了避开光谱重叠或信号干扰,量子点常被用作供体或受体。本部分实验将量子点作为荧光共振能量转移中的供体,在夹心反应和均相系统竞争方式中,量子点均能与受体荧光染料Cy5之间通过DNA的杂交作用实现能量转移,以而对目标序列进行测定。实验首先对量子点和C论文导读：652.1.4结论65-66第二节链式杂交反应结合适配体技术检测蛋白质探讨66-772.2.1引言66-672.2.2实验部分67-692.2.3结果与讨论69-762.2.4结论76-77参考文献77-82第三章量子点双组分荧光浅析新技术82-112第一节基于模板识别方式同时检测两种RNA分子的新技术探讨82-95

3.1.1引言82-831.2实验部分83-841.3结果与讨论

y5在载体上和均相溶液中的能量转移现象进行了考察,并进一步引入酶切循环放大的概念,采取“Y”型DNA分子结合方式,即三条DNA序列同时有着时DNA双链才能形成,并激活限制性内切酶,将其中一条分支切断,使受体与供体分离,并释放出目标序列,与其它辅助序列继续杂交,导致FRET信号的显著变化,建立了高灵敏度、高选择性的FRET-DNA检测方式。关键词：生物大分子论文量子点论文单组分论文多组分论文荧光共振能量转移论文
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Abstract8-11
第一章 绪论11-47
第一节 课题背景及作用11-12
第二节 文献综述12-34

1.2.1 核酸和蛋白质检测的探讨进展12-24

1.2.2 量子点概述及其在生物分子检测领域的运用24-34

第三节 论文的探讨内容34-35
参考文献35-47
第二章 链式杂交量子点放大方式检测特定序列DNA和蛋白质47-82
第一节 基于模板识别方式和链式杂交反应检测特定序列DNA47-66
2.

1.1 引言47-48

2.

1.2 实验部分48-52

2.

1.3 结果与讨论52-65

2.

1.4 结论65-66

第二节 链式杂交反应结合适配体技术检测蛋白质探讨66-77

2.1 引言66-67

2.2 实验部分67-69

2.3 结果与讨论69-76

2.4 结论76-77

参考文献77-82
第三章 量子点双组分荧光浅析新技术82-112
第一节 基于模板识别方式同时检测两种RNA分子的新技术探讨82-95
3.

1.1 引言82-83

3.

1.2 实验部分83-84

3.

1.3 结果与讨论84-94

3.

1.4 结论94-95

第二节 层层组装放大方式检测双组分DNA95-107
3.

2.1 引言95

3.

2.2 实验部分95-97

3.

2.3 结果与讨论97-106

3.

2.4 结论106-107

参考文献107-112
第四章 量子点荧光共振能量转移探讨112-127

4.1 引言112

4.2 实验部分112-114

4.3 结果与讨论114-124

4.4 结论124-125

参考文献125-127
总结127-129
已发表论文129
待投寄论文129-130
致谢130-131