研究通路二苯乙烯苷通过激活PI3K/Akt通路对MPTP诱导帕金森病小鼠模型神经保护作用中心

论文导读：中国古代作为一种补益和抗衰老的药物而被广泛利用。我们在临床中发现以何首乌为“君药”的方剂治疗PD确实有一定疗效。有报道显示何首乌的可溶性提取物(PME-Ⅰ)具有神经保护作用，可以减轻神经毒素诱发的DAergic神经元损伤，改善PD小鼠的行为学。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2
摘要：帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要的病理学特点为中脑黑质(Substantia nigra, SN)多巴胺能(Dopaminergic,DAergic)神经元进行性的丢失，伴随纹状体多巴胺(Dopamine, DA)含量显著下降。PD的病因不明，但探讨表明氧化应激和线粒体功能障碍在其发病机制中起重要作用。目前治疗PD的主要药物是左旋多巴类制剂，但其疗效随着病程的进展显著下降。探讨发现许多中草药及其提取物具有神经保护作用，在延缓或防止PD进展中显示出潜在的临床效益。何首乌，是一种传统的中草药，在中国古代作为一种补益和抗衰老的药物而被广泛利用。我们在临床中发现以何首乌为“君药”的方剂治疗PD确实有一定疗效。有报道显示何首乌的可溶性提取物(PME-Ⅰ)具有神经保护作用，可以减轻神经毒素诱发的DAergic神经元损伤，改善PD小鼠的行为学。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)为PME-Ⅰ的主要活性成分，探讨发现其具有抗氧化，抗炎，抑制氧化应激等作用。1--4--1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropy-ridine, MPTP)的活性代谢产物MPP+可以选择性的损伤DAergic神经元，造成纹状体DA衰竭，在猴子和小鼠中可以产生出类似于原发性PD的症状。我们最近的探讨证实TSG可以减轻MPP+诱导的PC12细胞凋亡，其机制可能与激活PI3K/Akt通路有关。为了进一步探讨TSG在动物体内的作用效果及其机制，我们选取MPTP亚急性损伤C57BL/6小鼠作为PD实验模型，首先观察了不同剂量的TSG干预后对该模型的行为学和神经组织学的影响，进一步探讨了TSG发挥神经保护作用的可能机制：是否通过激活PI3K/Akt通路。【目的】1.制备MPTP亚急性损伤PD小鼠模型。2.观察TSG对MPTP诱导的PD小鼠的行为学及神经组织学的影响。3.探讨TSG是否通过激活PI3K/Akt通路对MPTP诱导的PD小鼠发挥神经保护作用。【策略】1.动物分组和模型制备：实验动物随机分为4组。A组：正常生理盐水对照组，腹腔注射生理盐水0.3ml，1次/d，连续14d；B组：模型组，腹腔注射MPTP(30mg/kg,生理盐水溶)，1次/d，连续7d，后腹腔注射等体积生理盐水，1次/d，连续7d；C组和D组为TSG干预组，给药方式为：MPTP(30mg/kg)腹腔注射，连续7d，1h后分别给予TSG(20mg/kg)或(40mg/kg)灌胃1次/d，连续14d，在实验二中加E组，MPTP(30mg/kg)腹腔注射，连续7d，1h后给予TSG (40mg/kg)和LY294002(3.75mg/kg)灌胃，1次/d，连续14d。每天上午9:00~10:00给药，用爬杆实验和悬挂实验观察小鼠的行为学变化。2.给药后第14d，每组随机选取10只小鼠取脑制作冰冻切片，采取免疫荧光组织化学策略观察TSG对MPTP诱导的小鼠SN酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运体(DAT)阳性神经元数目的影响。3.采取蛋白质印迹法(Western blotting)分别检测各组小鼠纹状体中TH,DAT, Akt, p-Akt(ser473), GSK3β, p-GSK3β(ser9), BAD, Bcl-2, caspase-9和caspase-3的蛋白质表达情况。【结果】1.行为学检测结果显示：爬杆实验中，与正常生理盐水对照组相比，模型组小鼠Tturn和TLA时间指数显著延长，表明其出现了运动协调缺损。分别给予不同剂量的TSG (20,40mg/kg)可以改善Tturn时间指数的延长(P0.05)，但对改善其TLA时间指数的延长呈一定的剂量依赖性(P0.05, P0.01)。悬挂实验中，模型组小鼠两后肢均不能抓住细线，悬挂能力与正常对照组相比显著下降(P0.01)，而重复给予不同剂量的TSG可减轻此症状，其作用呈一定的剂量依赖性(P0.05, P0.01)。2.免疫荧光染色清晰地显示：TH和DAT阳性细胞主要分布于黑质致密部(Substantia论文导读：40mg/kg)干预后，TH和DAT阳性细胞显著升高到67.3±2.79，67.3±2.11(P0.01)。3.Westernblotting策略检测结果表明，与模型组小鼠相比，给予不同剂量的TSG后可以增加其纹状体TH和DAT蛋白的表达，此外，还可以提升纹状体Akt和GSK3β的磷酸化，上调Bcl-2/BAD比值，抑制caspase-9和caspase-3的活化。【结论】1.TSG以剂量依赖的方式改善P
nigra pars compacta, SNpc)，免疫荧光双标记表明TH与DAT共存。MPTP处理可引起TH和DAT阳性细胞数量显著下降，而TSG干预具有保护效应。统计学结果表明：与生理盐水对照组相比，模型组小鼠TH阳性细胞数目显著减少到34.2±2.77(P0.01)，DAT阳性细胞相应减少到32.2±1.89(P0.01)，低剂量的TSG(20mg/kg)干预后TH和DAT阳性细胞分别升高到45.8±2.06，39.4±0.98(P0.05)，而高剂量的TSG(40mg/kg)干预后，TH和DAT阳性细胞显著升高到67.3±2.79，67.3±2.11(P0.01)。3. Western blotting策略检测结果表明，与模型组小鼠相比，给予不同剂量的TSG后可以增加其纹状体TH和DAT蛋白的表达，此外，还可以提升纹状体Akt和GSK3β的磷酸化，上调Bcl-2/BAD比值，抑制caspase-9和caspase-3的活化。【结论】1. TSG以剂量依赖的方式改善PD小鼠的行为学,减轻MPTP对小鼠黑质DAergic神经元的损伤。2. TSG对MPTP亚急性损伤PD小鼠的神经保护作用机制可能涉及PI3K/Akt通路。关键词：帕金森病论文MPTP论文TSG论文神经保护论文TH论文PI3K/Akt通路论文
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中文摘要6-10
Abstract10-14
前言14-16
文献回顾16-31
实验

一、TSG 对 MPTP 诱导的 PD 小鼠模型的神经保护作用31-37

1 材料31-32
2 策略32-34
3 结果34-35
4 讨论35-37
实验

二、TSG 对 MPTP 诱导的 PD 小鼠模型神经保护作用机制探讨37-46

1 材料37-39
2 策略39-42
3 结果42-44
4 讨论44-46
小结46-47
参考文献47-67
附录67-75
个人简历和探讨成果75-77
致谢77