浅议粒子螺旋藻抗肿瘤肽分离及壳聚糖纳米粒子复合物制备

论文导读：。结果表明：在CSNPs浓度为50-100μg/mL时候，对MCF-7细胞体外生长有一定的抑制作用，最高可达16.95%。Y_2-CSNPs系统对MCF-7细胞体外生长具有一定的抑制作用，抑制率最高为26.05%；CSNPs和Y_2-CSNPs系统对HepG-2细胞体外生长几乎没有抑制作用。关键词：螺旋藻论文抗肿瘤肽论文分离论文纳米粒子论文本
摘要：螺旋藻含有大量蛋白质、丰富均衡的营养成分和多种生物活性物质，是一种优良的纯天然食品，被联合国粮农组织誉为“全球人类最理想的食品”。近年来，国内外人员探讨表明，螺旋藻具有抗疲劳、抗辐射、抗病毒、抑制肿瘤、抗过敏、增强免疫力等多种功能，使其成为探讨的热点。本论文以蛋白质含量丰富的螺旋藻粉末为原料，采取超声破碎和反复冻融的策略提取螺旋藻蛋白。用不同蛋白酶对其进行水解，超滤获得不同分子量水解液。用MTT法筛选具有较好抗肿瘤活性的水解液，并用葡聚糖凝胶柱分离纯化，将纯化后的抗肿瘤肽继续进行抗肿瘤活性筛选。将最后得到活性高的抗肿瘤肽与壳聚糖相互作用，形成抗肿瘤肽-壳聚糖纳米粒子复合物，并对纳米粒子复合物进行了一系列表征。其结果如下：（1）以水解度为指标，用L_9（3~4）正交实验确定了不同蛋白酶优化水解条件：胰蛋白酶水解历程中最优条件是温度42℃，pH=8，酶与底物的比3%，水解度为38.49%；碱性蛋白酶水解历程中最优条件是pH=8.5，温度50℃，酶与底物的比5%，水解度为31.16%；胃蛋白酶水解历程中最优条件是温度37℃，pH=2，酶与底物的比为6%，水解度为7.07%；木瓜蛋白酶水解历程中最优条件是温度55℃，pH=6.5，酶与底物的比4%，水解度为27.80%。（2）用MTT法探讨了不同酶水解螺旋藻蛋白的不同分子量水解液对人乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞(HepG-2)体外生长抑制作用。结果显示：当药物终浓度均为1mg/mL时，胰蛋白酶水解产物5-10KD多肽对人乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞(HepG-2)体外生长抑制率分别为45.19%，23.5%。（3）将胰蛋白酶5-10KD水解液经过葡聚糖凝胶柱（Sephadex G-50）分离纯化。最终确定洗脱条件为：洗脱速度为0.5mL/min，上样体积为2mL，洗脱液为超纯水，检测波长为215nm。按照出峰顺序共收集到三个峰。用福林酚法测得其肽浓度含量分别为57%，41%和50%。（4）用MTT法对分离纯化的三个组分进行对肿瘤细胞体外生长抑制作用探讨表明：当浓度均500μg/mL时，三种组分对人乳腺癌细胞（MCF-7）的体外生长抑制率分别为86%、98%和6%。对肝癌细胞（HepG-2）体外生长抑制率分别为76%、95%和28%。其中组分Y_2对两株细胞体外生长抑制作用最强，测得其对人乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞（HepG-2）的IC50分别为61.36和60.96μg/mL。（5）采取三聚磷酸钠（TPP）离子交联法制备壳聚糖纳米粒子（CS NPs），确定了制备壳聚糖纳米粒子的合适TPP浓度（0.1-0.5mg/mL），并对组分Y_2包裹，制备壳聚糖纳米粒子复合物（Y_2-CS NPs）。结果显示：随着TPP浓度的增大系统的粒径逐渐增大。当浓度为0.5mg/mL时，系统最稳定，Zeta电位为41.5mv，平均粒径为152.7nm。并采取多种表征策略，验证了抗肿瘤肽壳聚糖纳米粒子复合物的成功制备。（6）探讨了不同浓度Y_2对Y_2-CS NPs的包封率和载药量的影响。结果如下：Y_2-CSNPs的包封率随着组分Y_2浓度的增大而降低，当组分Y_2浓度由0.2mg/mL增加到1mg/mL时，包封率由42%下降到19%；而载药量出现了缓慢上升，由5%上升到15%。（7）采取MTT法，探讨了壳聚糖纳米粒子（CS NPs）和抗肿瘤肽壳聚糖纳米粒子复合物（Y_2-CS NPs）对人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG-2体外生长抑制情况。结果表明：在CS NPs浓度为50-100μg/mL时候，对MCF-7细胞体外生长有一定的抑制作用，最高可达16.95%。Y_2-CS NPs系统对MCF-7细胞体外生长具有一定的抑制作用，抑制率最高为26.05%；CS NPs和Y_2-CS NPs系统对HepG-2细胞体外生长几乎没有抑制作用。关键词：螺旋藻论文抗肿瘤肽论文分离论文纳米粒子论文
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ABSTRACT7-12
第一章 绪论12-24
1.1 螺旋藻的营养价值和功能1论文导读：章小结63-64结论和展望64-671.结论64-652.革新之处653.展望65-67参考文献67-74攻读硕士期间取得的探讨成果74-75致谢75-76附件76上一页12
2-13

1.1 螺旋藻的营养价值12-13

1.2 螺旋藻的生理功能13

1.2 生物活性肽探讨进展13-17

1.2.1 生物活性肽的介绍13-14

1.2.2 生物活性肽的制备策略及有着不足14

1.2.3 生物活性肽的分离纯化技术14-17

1.3 抗肿瘤肽探讨进展17-20

1.3.1 抗肿瘤肽的抗肿瘤机制17-18

1.3.2 抗肿瘤肽的来源18-20

1.4 壳聚糖探讨进展20-22

1.4.1 壳聚糖结构和性质20-21

1.4.2 壳聚糖纳米粒子的制备策略21-22

1.5 课题探讨作用及主要内容22-24

1.5.1 论文立题作用22

1.5.2 论文主要探讨内容22-24

第二章 螺旋藻酶解液的制备24-36

2.1 引言24

2.2 实验材料24-26

2.1 材料与试剂24-25

2.2 主要仪器设备25-26

2.3 实验历程与策略26-29

2.3.1 螺旋藻蛋白质的提取26

2.3.2 螺旋藻蛋白质含量的测定26-27

2.3.3 螺旋藻蛋白质酶解条件的优化探讨27-29

2.3.4 不同分子量大小酶解液的获得29

2.4 实验结果与讨论29-34

2.4.1 螺旋藻蛋白质的含量的测定29-30

2.4.2 胰蛋白酶水解条件的确定30-31

2.4.3 碱性蛋白酶水解条件的确定31-32

2.4.4 胃蛋白酶水解条件的确定32-33

2.4.5 木瓜蛋白酶水解条件的确定33-34

2.5 本章小结34-36

第三章 螺旋藻多肽活性探讨与抗肿瘤肽的分离36-54

3.1 引言36

3.2 实验材料36-38

3.

2.1 材料与试剂36-37

3.

2.2 实验仪器与设备37

3.

2.3 主要培养基和常用溶液配制37-38

3.3 实验历程与策略38-44

3.1 细胞培养38-39

3.2 MTT 法测定肿瘤细胞生长抑制率39-41

3.3 抗肿瘤活性肽的分离纯化41-43

3.4 多肽含量测定43-44

3.5 组分抗肿瘤活性探讨44

3.4 实验结果与讨论44-52

3.4.1 不同分子量酶解液对肿瘤细胞体外生长抑制作用44-46

3.4.2 抗肿瘤活性肽的初步分离纯化46-48

3.4.3 肽含量测定48-49

3.4.4 组分对肿瘤细胞体外生长抑制实验49-52

3.5 本章小结52-54

第四章 壳聚糖纳米粒子复合物的制备54-64

4.1 引言54

4.2 实验材料54-55

4.

2.1 材料与试剂54-55

4.

2.2 实验仪器与设备表55

4.3 实验历程与策略55-57
4.

3.1 制备壳聚糖醋酸溶液 （CS）55

4.

3.2 壳聚糖-多聚磷酸钠纳米粒子制备(CS NPs)55

4.

3.3 抗肿瘤肽-壳聚糖-多聚磷酸钠纳米粒子复合物制备(Y2-CS NPs)55

4.

3.4 纳米粒子的表征55-56

4.

3.5 纳米粒子载药量和包封率测定56

4.

3.6 壳聚糖纳米粒子及其复合物的抗肿瘤活性测定56-57

4.4 实验结果与讨论57-63

4.1 纳米粒子制备条件57

4.2 纳米粒子的表征57-60

4.3 纳米粒子载药量和包封率60-61

4.4 纳米粒子复合物抗肿瘤活性探讨61-63

4.5 本章小结63-64

结论和展望64-67

1.结论64-65

2. 革新之处65

3. 展望65-67

参考文献67-74
攻读硕士期间取得的探讨成果74-75
致谢75-76
附件76