探讨基因治疗纳米载体输送核酸药物分子用于癌症治疗

论文导读：摘要5-6ABSTRACT6-11第一章绪论11-341.1癌症治疗中核酸药物的临床运用和面对的不足11-141.2纳米药物载体的优势和在癌症治疗中的运用14-171.3癌症基因治疗和相关纳米药物载体17-201.4肿瘤血管增生和miRNA治疗20-231.5肿瘤特异性微环境和纳米颗粒输送的siRNA治疗23-251.6本课题的选题目的及主要探讨
摘要：癌症的产生和进展是一个非常复杂的历程,治疗策略常常涉及到与肿瘤的生长相关的方方面面。基于核酸药物的治疗手段可以通过外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常,或者下调在肿瘤组织中过量表达的癌基因来达到治疗癌症的目的。然而,核酸药物的体内给药依然是目前的最大挑战。本论文针对肿瘤中抑癌基因的缺失、血管增生和缺氧微环境的特点,构建了不同的核酸药物给药的纳米载体和输送系统,可高效将目的药物输送到特定的细胞内,体外和体内实验都体现出显著的肿瘤治疗效果。第一部分：设计合成了一种由低分子量聚乙烯亚胺(PEI)构成的刷状阳离子聚合物PHEMA-g-(PEI-b-PEG)作为基因治疗载体,输送表达野生型p53的质粒DNA,诱导肿瘤细胞凋亡。该载体分子的主链为聚(2-羟乙基丙烯酸甲酯),侧链为聚乙烯基亚胺-聚乙二醇。PHEMA-g-(PEI-b-PEG)体现出比支化聚乙烯亚胺(PEI25K,平均分子量25,000)低的细胞毒性,并有效和质粒DNA形成纳米颗粒。PHEMA-g-(PEI-b-PEG)与质粒DNA的复合物能更有效地被BT474细胞内吞,转染效率优于PEI25K。进一步利用PHEMA-g-(PEI-b-PEG)携载表达野生型p53的质粒DNA,可以成功提升BT474细胞中野生型p53的表达量,诱导细胞凋亡,提升对化疗药物阿霉素的敏感程度。第二部分：构建了环状RGD多肽(cRGD)修饰的阳离子脂质体-鱼精蛋白-透明质酸颗粒cRGD-LPH-NP,靶向输送miR-296的反义核酸(anti-miR-296AMO)到血管内皮细胞,抑制血管增生。cRGD-LPH-NP特异性输送anti-miR-296AMO到αvβ3整合素阳性的血管内皮细胞,下调目的miRNA表达,并进一步抑制由肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(HGS)诱导的血管形成和内皮细胞的迁移；基质胶塞模型实验证明携载anti-miR-296AMO的cRGD-LPH-NP在体内显著抑制CD31阳性内皮细胞向Matrigel中迁移,以而抑制血管增生第三部分：利用两种嵌段共聚物PCL29-b-PPEEA21和PCL40-b-PEG45制备了混合胶束纳米颗粒(MNP),输送siRNA药物,抑制肿瘤缺氧诱导因子HIF-la的表达,抑制了前列腺癌的生长。复合物MNPsiⅢF有效转染前列腺癌PC3细胞,在体外模拟缺氧条件下,下调HIF-la蛋白表达,抑制细胞增殖和迁移,并破坏血管的增生。在PC3细胞小鼠皮下肿瘤模型,通过尾静脉注射MNPsiⅢF有效抑制肿瘤生长,并抑制缺氧诱导的多药耐药性基因MDR1的表达,减少对化疗药物阿霉素的耐受性。关键词：基因治疗论文miRNA反义核酸论文siRNA药物论文纳米输送系统论文癌症治疗论文血管增生论文肿瘤缺氧微环境论文
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ABSTRACT6-11
第一章 绪论11-34

1.1 癌症治疗中核酸药物的临床运用和面对的不足11-14

1.2 纳米药物载体的优势和在癌症治疗中的运用14-17

1.3 癌症基因治疗和相关纳米药物载体17-20

1.4 肿瘤血管增生和miRNA治疗20-23

1.5 肿瘤特异性微环境和纳米颗粒输送的siRNA治疗23-25

1.6 本课题的选题目的及主要探讨内容25-27

参考文献27-34
第二章 刷状阳离子聚合物作为p53质粒DNA的载体用于乳腺癌治疗的探讨34-51

2.1 引言34-35

2.2 实验部分35-36

2.1 主要材料35

2.2 细胞株35

2.3 主要药品及试剂35-36

2.3 实验策略36-39

2.3.1 细胞传代培养36

2.3.2 MTT实验检测刷状聚合物PHEMA-g-(PEI-b-PEG)的生物相容性36-37
2.3.3 琼脂糖凝胶电泳实验检验PHEMA-g-(PEI-b-PEG)结合质粒DNA的能力37
2.3.4 PHEMA-g-(PEI-b-PEG)与质粒DNA复合物的粒径及表面电势37

2.3.5 细胞内吞实验37

2.3.6 细胞转染实验37-38

2.3.7 Western blo论文导读：颗粒cRGD-LPH-NP制备的优化56-583.4.2靶向颗粒cRGD-LPH-NP通过受体介导的方式被细胞内吞58-603.4.3利用cRGD-LPH-NP输送anti-miR-296AMO在体外水平有效降低miR-296的表达,并提升其下游的HGS蛋白含量60-613.4.4靶向输送anti-miR-296AMO在体外有效抑制血管增生61-633.4.5靶向输送anti-miR-296AMO在体内有效抑制血管增生
tting检测野生型p53蛋白的表达水平38

2.3.8 TUNEL荧光染色法检测体外培养细胞的凋亡情况38-39

2.3.9 乳腺癌细胞对阿霉素敏感性提升的验证39

2.4 结果与讨论39-47

2.4.1 刷状阳离子聚合物PHEMA-g-(PEI-b-PEG)没有显著的细胞毒性39-40
2.4.2 刷状阳离子聚合物PHEMA-g-(PEI-b-PEG)能够有效结合质粒DNA40-41
2.4.3 PHEMA-g-(PEI-b-PEG)具备输送质粒DNA进入细胞的能力41-42

2.4.4 PHEMA-g-(PEI-b-PEG)具备良好的细胞转染效率42-44

2.4.5 以PHEMA-g-(PEI-b-PEG)为载体的p53基因治疗效果显著44-46
2.4.6 PHEMA-g-(PEI-b-PEG)为载体的p53基因治疗推动肿瘤对化疗药物阿霉素敏感性46-47

2.5 本章小结47-48

参考文献48-51
第三章 利用cRGD官能化的纳米颗粒靶向输送miR-296反义核酸用于抗血管增生探讨51-69

3.1 引言51-52

3.2 实验材料52-54

3.

2.1 主要材料52-53

3.

2.2 实验动物53

3.

2.3 细胞株53

3.

2.4 主要药品及试剂53-54

3.3 实验策略54-56
3.3.1 靶向颗粒cRGD-LPH-NP和非靶向颗粒Non-targeted LPH-NP的制备54
3.3.2 cRGD-LPH-NP和Non-targeted LPH-NP的粒径及表面电势检测54-55
3.3.3 cRGD-LPH-NP和Non-targeted LPH-NP细胞内吞能力检测55

3.4 体外水平上抑制miR-296表达的检测55

3.5 miR-296下游调控蛋白表达的检测55

3.6 体外水平血管增生检测55-56

3.7 体外水平细胞迁移检测56

3.8 利用基质胶塞模型在体内检测血管增生的抑制效果56

3.4 结果与讨论56-66

3.4.1 对靶向颗粒cRGD-LPH-NP制备的优化56-58

3.4.2 靶向颗粒cRGD-LPH-NP通过受体介导的方式被细胞内吞58-60

3.4.3 利用cRGD-LPH-NP输送anti-miR-296 AMO在体外水平有效降低miR-296的表达,并提升其下游的HGS蛋白含量60-61
3.

4.4 靶向输送anti-miR-296 AMO在体外有效抑制血管增生61-63

3.

4.5 靶向输送anti-miR-296 AMO在体内有效抑制血管增生63-66

3.5 本章小结66

参考文献66-69
第四章 纳米胶束输送siRNA下调缺氧特异表达HIF-1α对肿瘤生长抑制的探讨69-89

4.1 引言69-70

4.2 实验材料70-72

4.

2.1 主要材料70-71

4.

2.2 实验动物71

4.

2.3 细胞株71

4.

2.4 主要药品及试剂71-72

4.3 实验策略72-76
4.

3.1 制备混合胶束颗粒(MNP)和MNP_(siRNA)复合物72-73

4.

3.2 MNP_(siRNA)复合物的稳定性检测73

4.

3.3 MNP和MNP_(siRNA)复合物的粒径和电势浅析73

4.

3.4 流式细胞术检测MNP_(FAM-siRNA)复合物被肿瘤细胞的内吞73

4.

3.5 体外缺氧条件下抑制HIF-1α表达的探讨73-74

4.3.6 体外缺氧条件下利用MNP_(siHIF)抑制H1F-1α表达对克隆形成的影响74
4.3.7 体外缺氧条件下利用MNP_(siHIF)抑制HIF-1α表达对细胞迁移的影响74
4.3.8 体外缺氧条件下利用MNP_(siHIF)抑制HIF-1α表达对血管增生影响的探讨74
4.3.9 MNP_(siHIF)抑制HIF-1α表达后细胞对阿霉素敏感性的探讨74-75
4.

3.10 裸鼠皮下前列腺癌模型的治疗探讨75

4.

3.11 肿瘤组织中的HIF-1α和MDR1表达水平检测75-76

4.

3.12 TUNEL染色检测乳腺癌原位肿瘤细胞凋亡76

4.

3.13 免疫组化检测细胞增殖76

4.4 结果与讨论76-86

4.1 混合胶束(MNP)能够有效包载siRNA形成复合物76-77

4.2 MNP_(siRNA)复合物被细胞有效内吞77-78

4.4.3 在体外模拟缺氧条件下MNP_(siHIF)对HIF-1α基因表论文导读：殖和推动凋亡发挥作用85-864.5本章小结86参考文献86-89附录常规试剂89-90附录主要溶液配制90-92附录主要仪器设备92-93附录常规实验策略93-98致谢98-99在读期间发表的学术论文与取得的探讨成果99-100上一页123
达的下调78-80
4.4.4 在体外模拟缺氧条件下转染MNP_(siHIF)抑制PC3细胞增殖和迁移80-81

4.5 在体外模拟缺氧条件下转染MNP_(siHIF)抑制血管增生81-82

4.6 MNP_(siHIF)对缺氧诱导的耐药性的抑制效果82-83

4.4.7 MNP_(siHIF)系统给药体内抑制肿瘤生长和提升对化疗药物敏感性83-85
4.4.8 MNP_(siHIF)系统给药通过抑制肿瘤中细胞增殖和推动凋亡发挥作用85-86

4.5 本章小结86

参考文献86-89
附录 常规试剂89-90
附录 主要溶液配制90-92
附录 主要仪器设备92-93
附录 常规实验策略93-98
致谢98-99
在读期间发表的学术论文与取得的探讨成果99-100