研究胰岛素慢病毒载体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰肌源性干细胞移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠实验
最后更新时间：2024-04-22
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论文导读：
摘要：目的：探讨慢病毒载体介导的胰岛素样生长因子-1（IGF-1）基因修饰的肌源性干细胞（MDSCs）移植对雌性压力性尿失禁大鼠模型的作用及可能机制，为细胞移植对策治疗女性压力性尿失禁提供新的论述依据。策略:1、体外原代MDSCs的分离、纯化、分化和鉴定。取Wistar大鼠腓肠肌，机械法和酶消化法后，采取改良差速贴壁法纯化大鼠原代MDSCs，通过倒置相差显微镜观察细胞的生长形态和分化情况，采取流式细胞仪术、细胞免疫荧光化学、免疫细胞化学对P3-MDSCs进行表型鉴定，同时对分化培养的P3-MDSCs进行MyHC蛋白检测。2、采取体外重组（in-fusion）技术，以携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的pGC-FU慢病毒载系统统作为基因转导的媒介，构建携带IGF-1基因重组的慢病毒表达载体（pGC-FU-IGF-1），通过聚合酶链式反应（PCR）、酶切和测序的方式鉴定所构建的载体并转染293T细胞，以荧光显微镜观察绿色荧光，以Western blot检测GFP蛋白的表达，以实时定量荧光PCR（RT-QPCR）检测慢病毒的滴度。将携带有IGF-1＆eGFP融合基因的慢病毒和仅携带eGFP的慢病毒感染大鼠MDSC（s分别为IGF-1/MDSCs组和GFP/MDSCs组），通过荧光表达情况以及酶联免疫吸附试验（ELISA）结果确定最佳感染复数（MOI）。3、取最佳MOI慢病毒感染MDSCs，待IGF-1/MDSCs组和GFP/MDSCs组达到90%融合后，模拟体内氧化应激微环境，体外建立过氧化氢（H2O2）诱导细胞凋亡模型，MTS法检测不同浓度不同时间的H2O2干预对MDSCs活性的影响，并通过流式、DNA ladder探讨H2O2对MDSCs凋亡的影响；Western blot检测MDSCs内抗凋亡相关蛋白P-T、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl与凋亡相关蛋白caspase-3、PARP的表达情况，探讨IGF-1基因修饰的MDSCs抑制细胞凋亡的可能机制。4、采取双侧阴部神经横断法（PNT）建立雌性压力性尿失禁大鼠模型，60只成年雌性大鼠随机均分为假手术组（S组）、溶剂对照组（PBS组）、空病毒感染的MDSCs移植组（GFP/MDSCs组）和IGF-1基因修饰的MDSCs移植组（IGF-1/MDSCs组），以1×106个/只细胞数注入尿道距膀胱约0.5cm处，每组再按治疗后1、2、4周分为3个亚组（每组5只）。采取尿动力学评价造模成功与否，并评价注射治疗1、2、4周后尿道闭合功能情况。注射治疗1周后，采取激光共聚焦扫描显微镜评价移植细胞存活情况。注射治疗4周后，免疫组织化学评价近端尿道毛细血管生成情况；伊红-苏木素（HE）及Masson染色评价近端尿道组织病理学转变；多重免疫荧光技术评价移植细胞的分化情况。在注射治疗的各个时间点，免疫组织化学和Western blot检测胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达情况。结果：1、所分离培养的MDSCs具有低粘附性、小圆形、折光性强的生物学特性，可以形成肌管，细胞表型鉴定为Sca-l（＋）、CD34（＋）、CD45（－）和dein（＋），符合MDSCs的特点。2、所构建的IGF-1＆eGFP重组慢病毒载体，经PCR、酶切和测序鉴定完全正确，转染293T细胞后能够正常表达，测得病毒滴度为2×108TU/ml。慢病毒感染MDSCs后，随着MOI值的增加，荧光强度逐渐增强，并伴随IGF-1分泌水平显著增加（p﹤0.01）。3、低溶度（﹤200uM）、短时间的H2O（2﹤0.5h）干预对MDSCs的活性无显著影响（p＞0.05），随着H_2O_2浓度的增加，作用时间的延长，MDSCs的活性显著下降（p﹤0.01），其中，GFP/MDSCs组下降更为显著（p﹤0.01）。通过DNA ladder凝胶电泳以及流式细胞仪双染检测浅析，发现H_2O_2能够诱导MDSCs caspase酶依赖性凋亡，而IGF-1能够拮抗H_2O_2作用，上调抗凋亡相关蛋白P-T、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl的表达（p﹤0.05），降低caspase-3、PARP的水解程度（p﹤0.01）。4、成功构建压力性尿失禁大鼠模型。细胞注射治疗1周后，IGF-1/MDSCs组的细胞存活率显著高于GFP/MDSCs组（p﹤0.01），4周后，移植的细胞可以分化为MyHC，其中IGF-1/MDSCs组的细胞分化强度强于GFP/MDSCs组。IGF-1/MDSCs组和GFP/MDSCs组在细胞治疗1、2、4周后无论是膀胱最大容量（MBC）还是腹压漏尿点压力（ALPP）均显著高于PBS组（p﹤0.01），低于假手术组（p＞0.05），其中IGF-1/MDSC组略高于GFP/MDSCs组（p＞0.05）。治疗4周后，IGF-1/MDSCs组新生的毛细血管密度显著高于GFP/MDSCs组（p﹤0.01），后者又高于PBS组及S组（p﹤0.01）。细胞治疗的各个时间点，IGF-1/MDSCs组的IGF-1和VEGF蛋白表达量与各组比较显著升高（p﹤0.01），而GFP/MDSCs组在细胞治疗1、2周后，显著高于S组及PBS组（p﹤0.01），4周后，降至正常水平（p＞0.05）。组织形态学观察发现：IGF-1/MDSCs组有较多新生血管及肌纤维形成，GFP/MDSCs组可见部分新生肌纤维和少许新生血管，PBS组可见尿道平滑肌、横纹肌层变性、萎缩，血管减少。定量肌/胶原比率发现：S组﹥IGF-1/MDSCs组﹥GFP/MDSCs组﹥PBS组（p﹤0.05）。结论：本探讨可以以Wistar大鼠中成功分离出纯度较高的MDSCs；成功构建IGF-1＆eGFP融合基因重组慢病毒表达载体，并能够安全有效地感染大鼠MDSCs，持续稳定表达；IGF-1基因修饰的MDSCs增强了其在移植微环境中的存活能力，可能与IGF-1/PI3K/T/NFκB/Bcl-2家族蛋白信号通路密切相关论文导读：
，并通过其旁分泌功能，共同改善尿道括约肌闭合功能。关键词：肌源干细胞论文慢病毒表达载体论文胰岛素样生长因子-1论文压力性尿失禁论文细胞治疗论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。英汉缩略语名称对照4-6
中文摘要6-9
ABSTRACT9-12
前言12-14
第一部分 原代大鼠肌源性干细胞的分离、纯化及成肌特性的观察14-28
引言14
材料和策略14-20
结果20-24
讨论24-27
小结27-28
第二部分 IGF-1＆eGFP 融合基因重组慢病毒表达载体的构建、鉴定及其在肌源性干细胞中的表达28-55
引言28
材料和策略28-44
结果44-52
讨论52-54
小结54-55
第三部分 IGF-1基因修饰的肌源性干细胞移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠模型的作用及机制55-94
前言55
材料和策略55-66
结果66-87
讨论87-92
小结92-94
结论94-95
参考文献95-111
致谢111-112
综述 胰岛素样生长因子推动骨骼肌生长和分化的探讨进展112-128
参考文献118-128
摘要：目的：探讨慢病毒载体介导的胰岛素样生长因子-1（IGF-1）基因修饰的肌源性干细胞（MDSCs）移植对雌性压力性尿失禁大鼠模型的作用及可能机制，为细胞移植对策治疗女性压力性尿失禁提供新的论述依据。策略:1、体外原代MDSCs的分离、纯化、分化和鉴定。取Wistar大鼠腓肠肌，机械法和酶消化法后，采取改良差速贴壁法纯化大鼠原代MDSCs，通过倒置相差显微镜观察细胞的生长形态和分化情况，采取流式细胞仪术、细胞免疫荧光化学、免疫细胞化学对P3-MDSCs进行表型鉴定，同时对分化培养的P3-MDSCs进行MyHC蛋白检测。2、采取体外重组（in-fusion）技术，以携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的pGC-FU慢病毒载系统统作为基因转导的媒介，构建携带IGF-1基因重组的慢病毒表达载体（pGC-FU-IGF-1），通过聚合酶链式反应（PCR）、酶切和测序的方式鉴定所构建的载体并转染293T细胞，以荧光显微镜观察绿色荧光，以Western blot检测GFP蛋白的表达，以实时定量荧光PCR（RT-QPCR）检测慢病毒的滴度。将携带有IGF-1＆eGFP融合基因的慢病毒和仅携带eGFP的慢病毒感染大鼠MDSC（s分别为IGF-1/MDSCs组和GFP/MDSCs组），通过荧光表达情况以及酶联免疫吸附试验（ELISA）结果确定最佳感染复数（MOI）。3、取最佳MOI慢病毒感染MDSCs，待IGF-1/MDSCs组和GFP/MDSCs组达到90%融合后，模拟体内氧化应激微环境，体外建立过氧化氢（H2O2）诱导细胞凋亡模型，MTS法检测不同浓度不同时间的H2O2干预对MDSCs活性的影响，并通过流式、DNA ladder探讨H2O2对MDSCs凋亡的影响；Western blot检测MDSCs内抗凋亡相关蛋白P-T、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl与凋亡相关蛋白caspase-3、PARP的表达情况，探讨IGF-1基因修饰的MDSCs抑制细胞凋亡的可能机制。4、采取双侧阴部神经横断法（PNT）建立雌性压力性尿失禁大鼠模型，60只成年雌性大鼠随机均分为假手术组（S组）、溶剂对照组（PBS组）、空病毒感染的MDSCs移植组（GFP/MDSCs组）和IGF-1基因修饰的MDSCs移植组（IGF-1/MDSCs组），以1×106个/只细胞数注入尿道距膀胱约0.5cm处，每组再按治疗后1、2、4周分为3个亚组（每组5只）。采取尿动力学评价造模成功与否，并评价注射治疗1、2、4周后尿道闭合功能情况。注射治疗1周后，采取激光共聚焦扫描显微镜评价移植细胞存活情况。注射治疗4周后，免疫组织化学评价近端尿道毛细血管生成情况；伊红-苏木素（HE）及Masson染色评价近端尿道组织病理学转变；多重免疫荧光技术评价移植细胞的分化情况。在注射治疗的各个时间点，免疫组织化学和Western blot检测胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达情况。结果：1、所分离培养的MDSCs具有低粘附性、小圆形、折光性强的生物学特性，可以形成肌管，细胞表型鉴定为Sca-l（＋）、CD34（＋）、CD45（－）和dein（＋），符合MDSCs的特点。2、所构建的IGF-1＆eGFP重组慢病毒载体，经PCR、酶切和测序鉴定完全正确，转染293T细胞后能够正常表达，测得病毒滴度为2×108TU/ml。慢病毒感染MDSCs后，随着MOI值的增加，荧光强度逐渐增强，并伴随IGF-1分泌水平显著增加（p﹤0.01）。3、低溶度（﹤200uM）、短时间的H2O（2﹤0.5h）干预对MDSCs的活性无显著影响（p＞0.05），随着H_2O_2浓度的增加，作用时间的延长，MDSCs的活性显著下降（p﹤0.01），其中，GFP/MDSCs组下降更为显著（p﹤0.01）。通过DNA ladder凝胶电泳以及流式细胞仪双染检测浅析，发现H_2O_2能够诱导MDSCs caspase酶依赖性凋亡，而IGF-1能够拮抗H_2O_2作用，上调抗凋亡相关蛋白P-T、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl的表达（p﹤0.05），降低caspase-3、PARP的水解程度（p﹤0.01）。4、成功构建压力性尿失禁大鼠模型。细胞注射治疗1周后，IGF-1/MDSCs组的细胞存活率显著高于GFP/MDSCs组（p﹤0.01），4周后，移植的细胞可以分化为MyHC，其中IGF-1/MDSCs组的细胞分化强度强于GFP/MDSCs组。IGF-1/MDSCs组和GFP/MDSCs组在细胞治疗1、2、4周后无论是膀胱最大容量（MBC）还是腹压漏尿点压力（ALPP）均显著高于PBS组（p﹤0.01），低于假手术组（p＞0.05），其中IGF-1/MDSC组略高于GFP/MDSCs组（p＞0.05）。治疗4周后，IGF-1/MDSCs组新生的毛细血管密度显著高于GFP/MDSCs组（p﹤0.01），后者又高于PBS组及S组（p﹤0.01）。细胞治疗的各个时间点，IGF-1/MDSCs组的IGF-1和VEGF蛋白表达量与各组比较显著升高（p﹤0.01），而GFP/MDSCs组在细胞治疗1、2周后，显著高于S组及PBS组（p﹤0.01），4周后，降至正常水平（p＞0.05）。组织形态学观察发现：IGF-1/MDSCs组有较多新生血管及肌纤维形成，GFP/MDSCs组可见部分新生肌纤维和少许新生血管，PBS组可见尿道平滑肌、横纹肌层变性、萎缩，血管减少。定量肌/胶原比率发现：S组﹥IGF-1/MDSCs组﹥GFP/MDSCs组﹥PBS组（p﹤0.05）。结论：本探讨可以以Wistar大鼠中成功分离出纯度较高的MDSCs；成功构建IGF-1＆eGFP融合基因重组慢病毒表达载体，并能够安全有效地感染大鼠MDSCs，持续稳定表达；IGF-1基因修饰的MDSCs增强了其在移植微环境中的存活能力，可能与IGF-1/PI3K/T/NFκB/Bcl-2家族蛋白信号通路密切相关论文导读：
，并通过其旁分泌功能，共同改善尿道括约肌闭合功能。关键词：肌源干细胞论文慢病毒表达载体论文胰岛素样生长因子-1论文压力性尿失禁论文细胞治疗论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。英汉缩略语名称对照4-6
中文摘要6-9
ABSTRACT9-12
前言12-14
第一部分 原代大鼠肌源性干细胞的分离、纯化及成肌特性的观察14-28
引言14
材料和策略14-20
结果20-24
讨论24-27
小结27-28
第二部分 IGF-1＆eGFP 融合基因重组慢病毒表达载体的构建、鉴定及其在肌源性干细胞中的表达28-55
引言28
材料和策略28-44
结果44-52
讨论52-54
小结54-55
第三部分 IGF-1基因修饰的肌源性干细胞移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠模型的作用及机制55-94
前言55
材料和策略55-66
结果66-87
讨论87-92
小结92-94
结论94-95
参考文献95-111
致谢111-112
综述 胰岛素样生长因子推动骨骼肌生长和分化的探讨进展112-128
参考文献118-128