谈南极南极海洋菌Pseudoaltermonassp.S-5胞外多糖结构与免疫活性

论文导读：昆明小鼠的免疫系统的影响,期望为南极资源的开发利用提供科学依据。1.通过对43株南极海洋菌的显微观察结合刚果红法和台盼蓝法筛选出产胞外多糖的菌株15株。16SrDNA鉴定结果表明,南极海洋菌S-5是一株假交替单胞菌Pseudoaltermonassp.S-5。由于假交替单胞菌是南极生态系统中最常见也是很重要的一类细菌,且S-5的产糖量相对而
摘要：南极气候酷寒,环境干燥,一些区域终年覆盖冰雪。南极海冰中有着着大量的微生物及其产生的胞外多糖,这些胞外多糖起着传输能量和保护细胞的作用。极端特殊的环境造就了不同于陆生环境的南极微生物。南极微生物是开发具有特殊运用价值的活性物质的资源库。一直以来,探讨较多的是南极微生物胞外多糖在生态系统中的作用,而这类多糖的免疫活性则探讨的较少,尤其是关于南极微生物胞外多糖对巨噬细胞的免疫调节功能还未见报道。本论文以中国第十九次南极科学考察采集得到的海冰海水中的43株南极细菌为材料,通过刚果红法和台盼蓝法染色筛选出15株产糖菌；其中一株高产糖南极海洋菌S-5经16S rDNA鉴定为假交替单胞菌属。确定该菌的培养条件后以该菌的发酵液中分离纯化得到纯度较高的多糖样品PEP。采取红外光谱(IR)、气相色谱(GC)、化浅析、1维核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)和2维核磁共振谱(COSY谱、NOESY谱、HSQC谱)浅析确定多糖PEP的结构,并探讨该胞外多糖对巨噬细胞的免疫调节功能以及对正常昆明小鼠的免疫系统的影响,期望为南极资源的开发利用提供科学依据。1.通过对43株南极海洋菌的显微观察结合刚果红法和台盼蓝法筛选出产胞外多糖的菌株15株。16S rDNA鉴定结果表明,南极海洋菌S-5是一株假交替单胞菌Pseudoaltermonas sp.S-5。由于假交替单胞菌是南极生态系统中最常见也是很重要的一类细菌,且S-5的产糖量相对而言比较高,所以对其进行了进一步的探讨。南极海洋菌Pseudoaltermonas sp.S-5细胞呈椭圆状,革兰氏染色阴性。2.对南极海洋菌S-5的实验室培养条件的探讨结果表明,南极海洋菌S-5在4-25℃下均能正常生长,由此确定其为适冷菌,即南极适冷菌Pseudoaltermonassp.S-5,该菌产胞外多糖的最佳产糖条件为：最适温度,9℃；最佳碳源,1%的葡萄糖；最佳pH值7.0左右。3.南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5发酵液经去菌体后浓缩,经乙醇沉淀、除蛋白后得到粗多糖CEP。粗多糖首先经DEAE-Fast Flow阴离子交换层析获得两个组分,将其中用蒸馏水洗脱下来的中性多糖命名为N-CEP, NaCl洗脱下来的酸性多糖为A-CEP, N-CEP进一步经过Sephadex G-75凝胶层析纯化,获得对称的单论文导读：液免疫历程和T细胞的增殖作用无显著作用。综上所述,南极适冷菌Pseudoaltermonassp.S-5胞外多糖PEP是由葡萄糖和半乳糖组成主链,并在葡萄糖6位上有分支连接甘露糖和半乳糖的复杂多糖；该糖在体外能刺激巨噬细胞的免疫活性,并且能通过激活巨噬细胞增强正常小鼠的上一页123456下一页
一峰,该组分为PEP。冷冻干燥后经碘-碘化钾反应、双缩脲反应、α-萘酚显色反应以及HPLC检测,无蛋白、核酸及其它杂质有着；表明样品纯度较高。以高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测定PEP的分子量为397kDa。4.南极适冷菌Pseudoaltermonas sp. S-5胞外多糖PEP经GC浅析确定其由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,但由于PEP的分子量过大,难以进行化浅析和核磁共振图谱采集,由此对PEP进行酸水解。经探讨最终确定了适宜的水解条件为0.01M三氟乙酸水解1h,水解产物经Bio-gel P2聚丙烯酰胺凝胶层析柱分离得到均一组分H-PEP,分子量经测定为4023Da。经红外光谱、化浅析、1D和2D核磁共振图谱浅析,确定H-PEP的单糖构型及其连接方式如下：5.体外细胞实验结果表明,南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP能在体外推动脾淋巴细胞的增殖,并且与ConA有协同作用。PEP能激活巨噬细胞,转变巨噬细胞的形态,50μg/ml PEP刺激使活化的巨噬细胞增加至细胞总数的45%,比对照高出137%；PEP还能提升巨噬细胞的噬菌能力,最高能使吞噬指数提升133%；PEP还能激活巨噬细胞酸性磷酸酶,并产生NO,分泌TNF-α、IL-1β。通过半定量RT-PCR实验,可以确定PEP处理巨噬细胞能提升TNF-α、IL-1β和iNOS基因的转录水平,这与细胞实验结果相符。6.以5、10和25mg/kg/day三个剂量的南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP对正常小鼠灌胃给药,连续10天后小鼠的脾指数上升,迟发型变态反应增强,此外,处理组小鼠腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶活性大大提升,吞噬能力增强,NO产量也有所提升,血清中TNF-α和1L-1β两种,细胞因子的含量比对照组高。另一方面,PEP对正常小鼠的B细胞和血清介导的溶血反应及脾淋巴细胞的增殖无显著的影响,这些结果说明PEP在本实验条件下可通过激活巨噬细胞增强机体的非特异性免疫,但是对体液免疫历程和T细胞的增殖作用无显著作用。综上所述,南极适冷菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP是由葡萄糖和半乳糖组成主链,并在葡萄糖6位上有分支连接甘露糖和半乳糖的复杂多糖；该糖在体外能刺激巨噬细胞的免疫活性,并且能通过激活巨噬细胞增强正常小鼠的论文导读：231.1多糖对免疫器官的作用19-201.2多糖对免疫细胞的作用20-221.2.1对T细胞和B细胞的影响201.2.2对巨噬细胞的作用20-211.2.3对NK细胞的作用211.2.4对树突状细胞的作用211.2.5对网状内皮系统(RES)的激活影响21-221.3对免疫分子的作用221.4对补系统统的作用22-232.多糖作用机制的探讨23-262.1多糖受体23-242.2多糖
的非特异性免疫作用和免疫调节作用,但是对体液免疫历程和T细胞的增殖作用无显著作用。本论文首次测定南极细菌胞外多糖对巨噬细胞的免疫调节功能,验证了南极微生物胞外多糖作为免疫调节剂的潜力,为具有特殊价值的南极微生物代谢产物的开发运用提供了论述基础。关键词：南极适冷菌Pseudoaltermonas论文sp.S-5论文胞外多糖论文分离纯化论文结构测定论文巨噬细胞论文免疫活性论文
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Abstract12-16
本论文縮写符号16-18
前言18-43

1. 多糖的免疫调节作用19-23

1.1 多糖对免疫器官的作用19-20

1.2 多糖对免疫细胞的作用20-22

1.2.1 对T细胞和B细胞的影响20

1.2.2 对巨噬细胞的作用20-21

1.2.3 对NK细胞的作用21

1.2.4 对树突状细胞的作用21

1.2.5 对网状内皮系统(RES)的激活影响21-22

1.3 对免疫分子的作用22

1.4 对补系统统的作用22-23

2. 多糖作用机制的探讨23-26

2.1 多糖受体23-24

2.2 多糖对细胞信息传导的影响24-25

2.1 对钙离子传导的影响24

2.2 对cAMP、cGMP信息系统的影响24-25

2.3 对NO的影响25

2.3 多糖对基因表达的影响25-26

3. 活性多糖的构效联系26-33

3.1 一级结构与生物活性的联系26-30

3.

1.1 单糖组成26-27

3.

1.2 糖苷键类型27-28

3.

1.3 分支情况28-29

3.

1.4 取代基29-30

3.2 高级结构与生物活性的联系30-31

3.3 理化性质与生物活性的联系31-33

3.1 分子量的影响31-32

3.2 溶解度32

3.3 粘度的影响32-33

3.4 电荷密度的影响33

3.5 核心寡糖片段的影响33

4 多糖的探讨策略33-37

4.1 多糖的分离纯化34-35

4.2 纯度浅析及分子量测定35

4.3 单糖组成浅析35

4.4 糖苷键的连接方式浅析35-36

4.5 核磁共振谱图剖析36-37

5. 微生物多糖37-39

5.1 黄原胶37

5.2 凝结多糖37

5.3 短梗论文导读：rmonassp.S-5最适培养条件的确定562.7Pseudoaltermonassp.S-5胞外多糖的提取562.8Pseudoaltermonassp.S-5胞外多糖的分离纯化56-572.9Pseudoaltermonassp.S-5胞外多糖PEP的纯度鉴定572.9.1碘-碘化钾反应572.9.2双缩脲反应572.9.3α-萘酚显色反应572.9.4紫外检测572.9.5高效液相色谱检测572.10Pseudoaltermonas
霉多糖(普鲁蓝)37-38

5.4 结冷胶38

5.5 小核菌葡聚糖或硬葡聚糖38

5.6 来自乳酸菌的胞外多糖38-39

5.7 海洋细菌胞外多糖39

6. 南极微生物胞外多糖39-42

6.1 南极微生物探讨概况40

6.2 南极微生物胞外多糖的探讨40-42

本课题探讨目的和作用42-43
第一章 南极海洋菌的分离筛选和菌种鉴定43-54

1.引言43-44

2. 材料和策略44-46

3. 实验结果46-52

4. 讨论52-53

5. 小结53-54

第二章 南极海洋菌S-5胞外多糖的制备与分离纯化54-63

1. 引言54-55

2. 材料和策略55-58

2.1 菌种55

2.2 试剂和溶液55

2.3 实验仪器和设备55

2.4 Pseudoaltermonas sp.S-5中多糖的测定55-56

2.5 Pseudoaltermonas sp.S-5生长曲线及产糖量的测定56

2.6 Pseudoaltermonas sp.S-5最适培养条件的确定56

2.7 Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖的提取56

2.8 Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖的分离纯化56-57

2.9 Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP的纯度鉴定57

2.9.1 碘-碘化钾反应57

2.9.2 双缩脲反应57

2.9.3 α-萘酚显色反应57

2.9.4 紫外检测57

2.9.5 高效液相色谱检测57

2.10 Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖PEP的分子量测定57-58

3. 结果58-61

3.1 Pseudoaltermonas sp.S-5生长曲线及产糖量58

3.2 不同培养温度下Pseudoaltermonas sp.S-5生长和胞外多糖产量58-61

4. 讨论61-62

4.1 培养条件的确定61

4.2 多糖的纯化策略及影响因素61-62

4.3 多糖纯度测定62

4.4 多糖的相对分子质量测定62

5. 小结62-63

第三章 多糖结构的测定与剖析63-83

1. 引言63

2. 材料与策略63-66

2.1 实验试剂63-64

2.2 仪器与设备64

2.3 南极海洋菌S-5胞外多糖PEP的红外光谱测定64

2.4 确定PEP多糖中是否含有糖醛酸64

2.5 PEP单糖组成浅析64-65

2.6 酸水解65

2.7 H-PEP的化浅析65-66

2.8 H-PEP论文导读：NOSmRNA转录水平97-1003.8.1PEP处理巨噬细胞不同时间后TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA转录水平97-983.8.2不同浓度PEP处上一页123456下一页
核磁共振谱浅析66

3. 结果66-81

3.1 PEP的红外光谱测定结果66-67

3.2 PEP中糖醛酸的确定67

3.3 PEP单糖组成浅析67-68

3.4 酸水解68-72

3.5 H-PEP的化浅析72-76

3.6 H-PEP核磁共振谱的剖析76-81

3.6.1 H-PEP核磁共振氢谱和碳谱的浅析结果76-77

3.6.2 H-PEP维核磁共振谱的浅析结果77-81

4. 讨论81-82

5 小结82-83
第四章 南极海洋菌S-5胞外多糖的免疫活性83-103
1 引言83-84
2 实验部分84-89

2.1 实验动物84

2.2 药品和试剂84

2.3 仪器和设备84

2.4 溶液的配制84-85

2.5 小鼠脾淋巴细胞增殖实验85-86

2.5.1 小鼠脾淋巴细胞的制备85

2.5.2 MTT法测定脾细胞增殖85-86

2.6 小鼠巨噬细胞免疫活性的测定86-88

2.6.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备86

2.6.2 PEP对巨噬细胞存活率的影响86

2.6.3 PEP对巨噬细胞形态的影响86

2.6.4 PEP对巨噬细胞吞噬能力的影响86-87

2.6.5 酸性磷酸酶活性的测定87

2.6.6 超氧阴离子的测定87

2.6.7 一氧化氮的测定87

2.6.8 细胞因子TNF-α和IL-1β的测定87-88

2.7 半定量RT-PCR测定TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平88-89

2.7.1 RNA的提取88

2.7.2 cDNA的合成88

2.7.3 PCR扩增88-89

2.7.4. PEP处理巨噬细胞不同时间后TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA转录水平89
2.7.5. 不同浓度PEP处理巨噬细胞后TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA水平89

2.8 统计学处理89

3. 结果89-100

3.1 小鼠脾淋巴细胞增殖结果89

3.2 PEP对巨噬细胞存活率的影响89-91

3.3 PEP对巨噬细胞形态的影响91-93

3.4 PEP对巨噬细胞吞噬能力的影响93

3.5 酸性磷酸酶活性的测定93-95

3.6 一氧化氮的测定95

3.7 细胞因子TNF-α和几-1β的测定95-97

3.8 半定量RT-PCR测定TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA转录水平97-100
3.8.1 PEP处理巨噬细胞不同时间后TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA转录水平97-98
3.8.2 不同浓度PEP处论文导读：α的影响110-1114.讨论111-1125.小结112-113第六章总结113-116参考文献116-130致谢130-131攻读学位期间发表的学术论文目录131-132学位论文评阅及答辩情况表132上一页123456
理巨噬细胞后TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA转录水平98-100
4 讨论100-102

5. 小结102-103

第五章 南极海洋菌S-5胞外多糖对正常小鼠免疫功能的影响103-113

1. 引言103

2. 实验部分103-106

2.1 实验动物103

2.2 试剂和溶液103-104

2.3 仪器和设备104

2.4 实验策略104-106

2.4.1 动物分组及给药策略104

2.4.2 小鼠脏器指数的测定104

2.4.3 小鼠迟发型变态反应的测定104-105

2.4.4 B细胞介导的溶血反应的测定105

2.4.5 血清溶血素生成的测定105

2.4.6 脾细胞增殖实验105

2.4.7 巨噬细胞产生NO的测定105

2.4.8 巨噬细胞酸性磷酸酶活性的测定105

2.4.9 巨噬细胞吞噬活性的测定105-106

2.4.10 小鼠血清中细胞因子IL-1β及TNF-α的测定106

2.4.11 数据统计处理106

3. 结果106-111

3.1 PEP对正常小鼠脏器指数的影响106-107

3.2 PEP对正常小鼠迟发型变态反应的影响107

3.3 PEP对正常小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响107

3.4 PEP对正常小鼠巨噬细胞酸性磷酸酶活性的影响107-109

3.5 PEP对正常小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响109-110

3.6 PEP对正常小鼠血清中细胞因子IL-1β及TNF-α的影响110-111

4. 讨论111-112

5. 小结112-113

第六章 总结113-116
参考文献116-130
致谢130-131
攻读学位期间发表的学术论文目录131-132
学位论文评阅及答辩情况表132