浅析成像内皮祖细胞参与胶质瘤微血管形成及功能活体影像学

论文导读：
摘要：探讨背景和目的：胶质瘤是脑内最常见原发性肿瘤，严重威胁人类健康。寻找胶质瘤靶向治疗的新案例、延长患者的存活期限一直是国内外学者努力的方向。探讨表明，内皮祖细胞（EPCs）在胶质瘤血管新生以及肿瘤转移、复发中均起到重要作用。EPCs有望成为抗肿瘤治疗的新靶点或携带抗肿瘤治疗药物的载体，并在实验性动物模型中取得初步成功。但就目前来看， EPCs对胶质瘤血管生成的作用一直有着争议，不同文献报道的EPCs参与到实验性肿瘤血管形成的能力不一，定量探讨发现含有EPCs的血管内皮占胶质瘤总血管比例以0%--50%不等。并且，目前缺乏较好的无创性活体示踪手段来评价EPCs在宿主组织中的存活、迁移及分布情况。这也限制了以EPCs作为载体或靶点的胶质瘤治疗新技术的进展。由此，需要用非侵入性的手段来对移植的EPCs进行活体动态观察，以评价移植EPCs在体内的分布、迁移及转归。随着分子影像技术的进展，特别是近期磁性纳米材料的出现，使得无创性活体示踪移植细胞成为可能，越来越受到探讨人员的关注。磁共振成像具有空间分辨率高、清晰的解剖成像及强大的功能成像浅析，可以成为显示磁性标记细胞在体内的生物分布的一个有效途径。将外源性移植细胞标记磁共振比较剂后，通过磁共振扫描能将细胞以其周围的组织中分辨出来。CT灌注成像（CT perfusion，CTP）脑功能成像策略之一，通过探讨脑组织的血流灌注状态以及组织血管化程度来获取微循环信息。CT灌注成像技术能无创性活体评价肿瘤微血管功能和活性的影响，通过定量浅析肿瘤区血流量（CBF）、脑血容量（CBV）、平均通过时间（MTT）、表面通透性（PS）等参数，反映肿瘤微血管的功能和活性变化。本探讨针对EPCs参与胶质瘤血管形成领域中有着的一些不足，采取磁共振活体示踪及CT灌注成像技术开展对EPCs参与胶质瘤新生血管形成的定性、定量探讨，将有助于了解EPCs与胶质瘤血管生成的时空联系，进一步明确EPCs对肿瘤血管生成的影响，为更好的运用以EPCs为靶点/载体的抗肿瘤治疗提供实验依据。探讨策略：1、以大鼠骨髓作为EPCs的主要来源，利用密度梯度离心法分离出单个核细胞（Mononuclear cells, MNCs），再利用内皮系选择性培养基EGM-2MV筛选出高纯度的EPCs，并对培养的细胞进行了免疫表型检测、内皮功能浅析和体外趋瘤性实验。2、以PLL和jetpet-FlouR分别介导两类磁性比较剂Resovist和Gd-DTPA标记EPCs，设置不同的标记浓度组，探讨Resovist和Gd-DTPA标记效率和体外对细胞生物学特性的影响。进一步采取3.0-T磁共振对不同浓度Resovist和Gd-DTPA标记的细胞进行扫描，浅析其影像信号特点。比较浅析Resovist和Gd-DTPA标记细胞的特点和优劣性。3、建立大鼠脑胶质瘤原位模型，通过鼠尾静脉移植25ug/ml Resovist标记的EPCs。利用3.0-T磁共振活体示踪EPCs靶向胶质瘤的时空分布；利用CT灌注成像浅析EPCs参与构建胶质瘤微血管血流动力学变化；通过病理检测和激光共聚焦进一步证实EPCs参与形成的胶质瘤微血管的形态结构和功能活性。探讨结果:1、通过密度梯度离心法结合条件培养法能获得具有祖细胞自我更新的能力并能诱导分化为内皮细胞的EPCs。骨髓来源的EPCs培养初期细胞CD133、CD34和VEGFR2呈阳性表达，经诱导培养后，CD133表达逐渐降低、而CD34和VEGFR2表达增高，同时细胞开始表达内皮表型CD31和vWF。进一步对细胞内皮功能浅析证实所培养的细胞具备内皮功能，能摄取低密度乙酰化脂蛋白和结合荆豆凝集素，具有体外形成血管的能力。EPCs在体外对胶质瘤具有显著趋向性，且同C6胶质瘤细胞数量有着相关性。2、采取Resovist和Gd-DTPA均能有效标记细胞， Resovist的最佳标记浓度范围为25-50ug/ml；Gd-DTPA的最适标记浓度为25ug/ml；磁共振T2序列为检测Resovist标记细胞的最佳序列，磁共振T1序列为检测Gd-DTPA标记的最佳序列。Resovist较Gd-DTPA更适合标记细胞，其操作方式简单便捷，具有较高的标记效率且对细胞的生物学特性影响较小。Gd-DTPA能由于具有T1正性比较效应，能有效弥补Resovist信号与某些疾病信号（如出血、金属蓄积、空气等）难以辨别的不足。3、Resovist标记的EPCs能向肿瘤定向迁移，并能引起磁共振T2信号变化。EPCs主要归巢至肿瘤边缘区，在磁共振T2WI像上呈低信号，随着时间延长，细胞归巢数量增加，相应信号转变的程度和范围均增大。普鲁士蓝检测结果同磁共振示踪具有良好的一致性，通过比较肿瘤组织和肾脏、脾脏、肺脏等组织蓝染细胞数，肿瘤边缘组织的阳性细胞数量显著高于非靶器官组织，亦证实循环性EPCs对胶质瘤具有显著的靶向性。采取CT灌注成像浅析EPCs移植后肿瘤区不同部位的血流动力学变化，其结果可重复性高，并与病理组织学MVD检测具有良好的一致性。定量浅析表明EPCs移植后，显著推动了肿瘤边缘区的血管生成，其综合贡献值约为15.09%-20.06%。激光共聚焦三维扫描能很好的显示EPCs参与形成肿瘤微血管的结构和形态。EPCs主要整合至血管的盲端或新生血管的分支，在肿瘤的血管构建中主要起支撑作用，通过参与形成新生血管的分支点，与母体血管形成相互连接且杂乱的血管网。探讨结论：外源性EPCs主要归巢至肿瘤的边缘，整合至血管的分支点或盲端，参与构筑肿瘤微血管形成。定量浅析表明EPCs移植后120小时显著推动了胶质瘤边缘区血管生成，其贡献度约为15.09%-20.06%。采取磁共振和CT灌注等影像学技术能无创性活体示踪EPCs移植后在宿主体内的迁移和转归，为今后以干细胞治疗为基础的临床运用提供强有力的监测手段。关键词：胶质瘤论文内皮祖细胞论文细胞标记论文磁共振成像论文CT灌注成像论文血管生成论文
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摘要8-11
Abstract11-15
前言15-21
参考文献18-21
第一部分：大鼠骨髓内皮祖细胞分离、培养与鉴定21-38
前言21
材料与策略21-27
结果27-32
讨论32-35
小结35-36
参考文献36-38
第二部分：磁共振体外示踪 Resovist 和 Gd-DTPA 标记 EPCs 的实验探讨38-59
前言38-39
材料与策略39-43
结果43-52
讨论52-55
小结55-56
参考文献56-59
第三部分：磁共振活体示踪及 CT 灌注成像评价 EPCs 参与形成的胶质瘤微血管功能及活性探讨59-82
前言59-60
材料与策略60-65
结果65-75
讨论75-78
小结78-79
参考文献79-82
全文总结82-84
致谢84-85
文献综述

一、内皮祖细胞与肿瘤血管生成探讨进展85-94

参考文献90-94
文献综述

二、干细胞磁性标记探讨进展94-100

参考文献97-100
攻读博士学位探讨生期间发表的论文100-101