试谈细胞系真菌多糖诱导肝癌细胞系凋亡探讨及对EHV-1疫苗免疫调节作用前言

论文导读：几个部分。(1)运用水提沉醇的方式获取桑黄粗多糖,并运用硫酸苯酚法、DNS法和BCA法测定各种成分的含量,采取DEAE-SepharoesF.F.离子柱层析和SephacrylS-200凝胶柱层析策略进行纯化,获得均一多糖,并采取体外淋巴细胞增殖实验检测组分的活性。结果：桑黄多糖PLP-B1组分具有体外生物学活性；(2)运用具有活性的桑黄PLP-B1组分,采取
摘要：肝细胞癌症已成为全球常见的肿瘤疾病,尤其在亚洲和非洲,发病率和患病率极高。数据显示,肝细胞癌的发病率已占到人类癌症总发病率的6%,位居第三位,已成为阻碍人类健康的主要不足。理由之一在于肝癌细胞具有高的侵袭性,导致肝癌具有高度转移性。癌症的转移有着许多内部机制的相互作用,包括细胞增殖失控、侵袭到周边组织、侵袭到人类机体的远端以及粘附,侵袭和依附到其它器官和组织上。肿瘤的生长和转移需要新生的血管,这些血管的萌发来自于毛细血管。由此,抑制癌细胞的增殖、侵袭以及癌细胞之间介导新生血管的新生,将会抑制癌症的转移以及进一步提升肝癌患者的存活。桑黄、灵芝和黑木耳都属于担子菌,主要生长在亚洲和美洲,在传统的东方医学系统中,药用真菌已得到显著的认可。以药用真菌中分离到的生物活性物质如多糖和以α-和β-糖苷键相连的蛋白杂聚糖。这些复杂的多糖化合物已以许多真菌物种中分离出来,并证明具有免疫刺激和抗癌活性以及可以刺激T淋巴细胞的增殖、激活B淋巴细胞以及诱导来源于树突状细胞的成熟骨髓瘤细胞的功能。本课题组已经通过电镜观察凋亡小体及流式Annexin V-FITC/PI染色等策略证明了桑黄粗多糖可诱导HepG2细胞凋亡,并阐述了桑黄粗多糖诱导HepG2细胞凋亡的作用与Bax的表达增加、抑制Bcl-2的表达,以而转变Bcl-2/Bax比例有关。基于以上理由,本探讨运用桑黄多糖(PL)、灵芝多糖(GL)和黑木耳多糖(AA),初步探讨了三种真菌多糖抑制肝癌细胞系HepG2和Bel-7404细胞增殖的分子机制以及作为生物调节剂对于疫苗免疫后小鼠的免疫调节作用。本探讨分以下几个部分。(1)运用水提沉醇的方式获取桑黄粗多糖,并运用硫酸苯酚法、DNS法和BCA法测定各种成分的含量,采取DEAE-Sepharoes F.F.离子柱层析和Sephacryl S-200凝胶柱层析策略进行纯化,获得均一多糖,并采取体外淋巴细胞增殖实验检测组分的活性。结果：桑黄多糖PLP-B1组分具有体外生物学活性；(2)运用具有活性的桑黄PLP-B1组分,采取细胞增殖、细胞活性、细胞粘附与侵袭等试验验证该物质是否可以抑制HepG2细胞。结果：桑黄多糖PLP-B1组分可以有效抑制HepG2细胞的增殖、粘附和侵袭特性；(3)运用桑黄PLP-B1组分做细胞周期和细胞凋亡试验,验证该物质是否能引发HepG2细胞产生凋亡。结果,桑黄多论文导读：
糖PLP-B1组分可以诱导HepG2产生凋亡及致使HepG2细胞阻滞于S期而显著抑制HepG2细胞的增殖和细胞集落的形成；(4)运用桑黄多糖(PL)作为免疫调节剂,验证是否在疫苗免疫中具有免疫调节作用。试验包括抗体检测,CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞百分率以及组织切片HE染色等。结果：桑黄多糖(PL)可以提升免疫组的抗体效价,并保持机体抗体水平的持续增加,HE染色结果也表明在正常范围内,证实高剂量的桑黄多糖可以提升机体的免疫力。外周血中CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞的检测结果,证明桑黄多糖可以刺激机体的淋巴细胞的数量增殖,并具有机体免疫调节作用；(5)运用桑黄多糖(PL)、灵芝多糖(GL)和黑木耳多糖(AA),采取细胞增殖和软琼脂试验,验证三种多糖是否可以抑制HepG2和Bel-7404细胞的增殖。结果：三种多糖对于HepG2和Bel-7404两株肝癌细胞系细胞具有显著的抑制癌细胞增殖的作用；(6)运用桑黄多糖、灵芝多糖和黑木耳多糖,采取细胞凋亡、细胞周期和Westernblot试验验证三种多糖抑制HepG2和Bel-7404细胞的增殖和细胞凋亡的分子机制。结果：三种多糖通过诱导细胞产生凋亡和阻滞癌细胞于G1和／或S期而抑制癌细胞的增殖。诱导的机制包括通过下调T激酶磷Thr308或／和Ser473两个磷酸化位点而激活T活性,以而激活PI3K/T信号通路；激活Bcl-2家族中制约蛋白的比率以而转变线粒体膜的通透性,释放凋亡因子细胞色素C和Smac诱导细胞产生凋亡,以而激活线粒体信号通路；通过上调p27Kip或／和p21cip的表达量,抑制cycpn D1/CDK4和cycpn E/CDK2两个复合物的活性,阻滞癌细胞于G1和／或S期而抑制癌细胞的增殖。(7)运用三种真菌多糖处理HepG2肝癌细胞,提取总蛋白,运用双向电泳技术对处理组和正常细胞的蛋白质表达图谱进行了比较浅析,经质谱鉴定并结合生物信息学浅析,共鉴定出59个差别表达的蛋白,通过Western blot和Real time PCR两种策略验证其中两个蛋白点。关键词：真菌多糖论文肝癌细胞系论文细胞凋亡论文细胞周期论文线粒体信号通路论文双向电泳论文
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3.2.8人工感染Balb/c小鼠病毒检测59-60上一页12345下一页

摘要4-6
Abstract6-17
1 绪论17-36

1.1 课题背景17-18

1.1 课题来源17

1.2 课题的目的和作用17-18

1.2 国内外探讨进展18-35

1.2.1 桑黄的探讨概况18-21

1.2.2 灵芝的探讨概况21-26

1.2.3 黑木耳探讨概况26-28

1.2.4 药用真菌与癌症治疗28-30

1.2.5 线粒体凋亡通路30-35

1.3 探讨的主要内容35-36

2 桑黄多糖抑制肝癌细胞增殖以及诱导细胞凋亡的作用36-52

2.1 实验材料与仪器36-39

2.

1.1 材料36

2.

1.2 试剂36-37

2.

1.3 仪器37

2.

1.4 试剂配制及培养基37-39

2.2 实验策略39-42

2.1 细胞培养39

2.2 桑黄多糖的提取及含量测定39-40

2.3 小鼠淋巴细胞增值率测定40-41

2.4 桑黄多糖分离与纯化41

2.5 细胞增殖试验41

2.6 细胞活力试验41

2.7 软琼脂克隆试验41

2.8 细胞粘附试验41-42

2.9 细胞侵袭试验42

2.10 细胞周期检测试验42

2.11 数据统计学浅析42

2.3 结果与浅析42-49

2.3.1 桑黄粗多糖的提取分离42-44

2.3.2 小鼠淋巴细胞增值率测定44

2.3.3 粗多糖PLP60的纯化44-45

2.3.4 PLP60-B1组分对HepG2细胞增殖的抑制作用45-47

2.3.5 软琼脂克隆试验47

2.3.6 多糖PLP60-B1组分对HepG2细胞粘附和侵袭的抑制作用47-48

2.3.7 流式细胞术检测HepG2细胞周期分布48-49

2.4 讨论49-50

2.5 本章小结50-52

3 桑黄多糖对EHV-1疫苗免疫Balb/c鼠的免疫调节作用52-66

3.1 实验材料与仪器53-54

3.

1.1 材料53

3.

1.2 试剂与培养基53-54

3.

1.3 仪器54

3.2 实验策略54-60
3.

2.1 桑黄多糖的提取54

3.

2.2 疫苗EHV-1的制备54-56

3.

2.3 病毒TCID_(50)测定56-57

3.

2.4 动物分组及处理57

3.

2.5 抗体效价的测定57-59

3.

2.6 T淋巴细胞亚群的检测59

3.

2.7 肺脏的病理观察59

3.2.8 人工感染Balb/c小鼠病毒检测59-60论文导读：电镜(TEM)试验694.2.6流式细胞术浅析69-704.2.7细胞周期检测704.2.8蛋白质免疫印迹70-724.3结果与浅析72-804.3.1真菌多糖对HepG2细胞增殖的抑制作用72-734.3.2真菌多糖对HepG2和Bel-7404细胞增殖的软琼脂试验73-744.3.3真菌多糖诱导HepG2和Bel-7404细胞凋亡试验74-754.3.4电镜观察真菌多糖诱导HepG2和Bel-7404细胞

3.3 结果与浅析60-64

3.1 桑黄多糖(PL)对EHV-1抗体效价的影响60-61

3.2 桑黄多糖(PL)对外周血CD3~+淋巴细胞的影响61

3.3 桑黄多糖(PL)对外周血CD4~+/CD8~+比值的影响61-62

3.4 病理切片HE染色结果浅析62-63

3.5 攻毒后病毒检测情况63-64

3.4 讨论64-65

3.5 本章小结65-66

4 真菌多糖抑制肝癌细胞增殖信号通路的探讨66-84

4.1 实验材料67-68

4.

1.1 试验材料67

4.

1.2 试验试剂67

4.

1.3 抗体67-68

4.

1.4 实验仪器68

4.

1.5 试剂配制及培养基68

4.2 实验策略68-72
4.

2.1 细胞培养68-69

4.

2.2 桑黄、灵芝和黑木耳多糖提取及含量测定69

4.

2.3 细胞增殖试验69

4.

2.4 细胞软琼脂克隆试验69

4.

2.5 电镜(TEM)试验69

4.

2.6 流式细胞术浅析69-70

4.

2.7 细胞周期检测70

4.

2.8 蛋白质免疫印迹70-72

4.3 结果与浅析72-80
4.

3.1 真菌多糖对HepG2细胞增殖的抑制作用72-73

4.

3.2 真菌多糖对HepG2和Bel-7404细胞增殖的软琼脂试验73-74

4.

3.3 真菌多糖诱导HepG2和Bel-7404细胞凋亡试验74-75

4.

3.4 电镜观察真菌多糖诱导HepG2和Bel-7404细胞凋亡75

4.

3.5 细胞周期试验75-77

4.3.6 HepG2和Bel-7404细胞中p21~(Cip1),p27~(Kip1)和cycpn/CDK的水平77-78
4.3.7 HepG2和Bel-7404细胞中P13K/PTEN/T途径的表达水平78-79
4.

3.8 HepG2和Bel-7404细胞中线粒体途径的表达水平79-80

4.4 讨论80-82

4.5 本章小结82-84

5 真菌多糖调控HepG2细胞差别表达蛋白的鉴定与浅析84-102

5.1 实验材料与仪器84-85

5.

1.1 试验材料84

5.

1.2 试验试剂84

5.

1.3 实验仪器84-85

5.2 实验策略85-87
5.

2.1 双向电泳的样品制备85

5.

2.2 跑胶85

5.

2.3 蛋白点浅析85-86

5.

2.4 质谱的浅析和鉴定86

5.

2.5 Western blot鉴定86

5.

2.6 实时荧光定量PCR86-87

5.3 结果与浅析87-论文导读：995.3.1总蛋白质的表达谱87-885.3.2ImagingMaster2D凝胶图像浅析88-895.3.3蛋白差别点的质谱鉴定89-935.3.4差别表达蛋白质细胞定位935.3.5验证试验93-995.4讨论99-1005.5本章小结100-102结论102-104参考文献104-118攻读学位期间发表的学术论文118-119致谢119-120上一页12345
99
5.

3.1 总蛋白质的表达谱87-88

5.

3.2 Imaging Master 2D凝胶图像浅析88-89

5.

3.3 蛋白差别点的质谱鉴定89-93

5.

3.4 差别表达蛋白质细胞定位93

5.

3.5 验证试验93-99

5.4 讨论99-100

5.5 本章小结100-102

结论102-104
参考文献104-118
攻读学位期间发表的学术论文118-119
致谢119-120