谈叶绿体豌豆镁离子螯合酶功能和酶活性调控

论文导读：3BiFC载体的构建45

2.4VIGS载体的构建45-463重组蛋白原12下一页

摘要：镁离子螯合酶是叶绿素生物合成途径中的第一个酶。它催化镁离子插入原卟啉Ⅸ中形成镁原卟啉Ⅸ,对叶绿素的合成起到决定性的调控作用。镁离子螯合酶由三个亚基组成,分别是I (BchI/CHLI)、D (BchD/CHLD)和H (BchH/CHLH)亚基。本探讨首先探讨豌豆镁离子螯合酶I亚基(PsCHLI)氨基酸不同结构域的功能；其次利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术分别获得I和D亚基的沉默(VIGS-CHLI和VIGS-CHLD)豌豆植株,并以此为材料对镁离子螯合酶的生物学功能进行系统地探讨；最后初步阐明叶绿体硫氧还蛋白(TRXs)对镁离子螯合酶I亚基的氧化还原调控以及对镁离子螯合酶活性的调控机制。本探讨主要结果如下：PsCHLI氨基酸氨基端(PsCHLI-N,以Va163到SerTM)介导I亚基形成同源聚合体以及与豌豆镁离子螫合酶D亚基(PsCHLD)的相互作用；PsCHLI氨基酸羧基端(PsCHLI-C,以Ser337到Ser422)虽不参与相互作用,却与酶活性紧密相关。只有当PsCHLI氨基酸氨基端和羧基端串联在一起时(PsCHLI-NC,以Va163到Ser422),I亚基才能发挥ATP酶活性和镁离子螯合酶活性。与VIGS-GFP对照植株相比,VIGS-CHLI和VIGS-CHLD植株出现黄化表型,并且所检测的各种生理生化指标都发生变化：叶片中镁离子螯合酶活性和叶绿素含量都下降90%,5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevupnic acid,ALA)合成速率下降50%。叶绿体内囊体膜系统发育不建全,叶绿体类核的结构发生转变并且光合作用效率下降。活性氧物质(ROS)的产生和抗氧化系统对ROS的清除能力之间的动态平衡被打破,以而造成ROS的积累。VIGS植株叶片代谢组学浅析结果表明,镁离子螯合酶活性与叶绿体和线粒体等细胞器中的初级代谢途径密切相关。此外,CHLD参与调控光合作用相关的核基因(photosynthesis-associated nuclear genes, PhANGs)的转录。沉默CHLD和CHLI基因都会导致沉默植株叶片中光捕获叶绿素结合蛋白含量的下降,同时影响四吡咯生物合成相关蛋白在叶片中的含量。酵母双杂交和双分子荧光互补实验结果表明PsTRX-F和PsCHLI在体内具有相互作用。在镁离子螫合酶三个亚基和GUN4中,I亚基是硫氧还蛋白F唯一的靶蛋白。在体外,还原的PsTRX-F能够激活PsCHLI的ATP酶活性,并且增强CHLI,CHLD和CHLH以及调控蛋白GUN4重组的镁离子螯合酶活性。在体内,单独沉默PsTRX-F基因(VIGS-TRX-F)并没有引起沉默植株的表型、叶绿素含量、镁离子螯合酶活性以及体内I亚基的氧化还原状态的显著变化。但是,共沉默PsTRX-F和PsTRX-M基因(VIGS-TRX-FITRX-M)的豌豆植株出现黄绿色表型,镁离子螯合酶活性下降30%,叶绿素含量降低60%,ALA合成速率下调20%并且22%的I亚基处于氧化状态。在VIGS-TRX-FITRX-M中,叶绿体氧化还原状态的变化导致ROS的积累,产生氧化还原信号来介导叶绿体到细胞核的反向信号传导,以而引起PhANGs转录的变化。此外,TRX-F和TRX-M还作为重要的调控蛋白参与调控四吡咯生物合成相关蛋白在叶片中的稳定性。综上所述,镁离子螫合酶不仅参与叶绿素生物合成,而且是四吡咯生物合成代谢途径的关键调控酶,其活性还与ROS的动态平衡,叶绿体和细胞器之间的初级代谢以及反向信号传导有关。此外,叶绿体硫氧还蛋白在氧化还原水平,转录水平以及翻译后水平对镁离子螯合酶活性进行调控。这一系列结果揭示了镁离子螯合酶在植物细胞中的生物学功能和活性调控机制。关键词：反向信号论文镁离子螯合酶论文豌豆论文氧化还原调控论文叶绿体论文CHLD论文CHLI论文PhANGs论文TRX-F论文TRX-M论文
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Abstract10-12
缩略语表12-13
1 前言13-43

1.1 四吡咯生物合成代谢途径综述13-20

1.1 四吡咯生物合成代谢途径的酶促反应步骤13-14

1.2 四吡咯生物合成代谢途径的调控14-16

1.3 四吡咯中间代谢产物介导的叶绿体到细胞核反向信号传导16-20

1.2 叶绿素是光合自养生物中最重要的四吡咯化合物之一20-24

1.3 镁离子螯合酶是叶绿素合成的关键调控酶24-27

1.3.1 镁离子螯合酶是由I、D和H三个亚基组成的异源聚合酶24-26

1.3.2 镁离子螫合酶的催化机制分为两个步骤26-27

1.4 镁离子螯合酶活性调控的探讨27-31

1.4.1 CHLI、CHLD和CHLH基因表达的调控28

1.4.2 镁离子螯合酶活性受昼夜节律的调节28-29

1.4.3 镁离子螫合酶活性受叶绿体中氧化还原状态的调控29-30

1.4.4 镁离子螫合酶活性受调控蛋白GUN4的调节30-31

1.5 镁离子螯合酶各亚基之间的相互联系和影响31-32

1.6 镁离子螯合酶参与的其它生物代谢途径32-34

1.7 病毒介导的基因沉默技术是反向遗传学探讨的重要工具34-41

1.7.1 VIGS技术的原理34-35

1.7.2 VIGS技术的进展35-39

1.7.3 VIGS技术的优缺点39-40

1.7.4 VIGS技术在豌豆反向遗传学探讨中的运用40-41

1.8 本探讨的目的与作用41-43

2 材料与策略43-63

2.1 实验材料43-44

2.

1.1 豌豆材料43

2.

1.2 菌株43-44

2.2 载体的构建44-46

2.1 原核表达载体的构建44

2.2 酵母双杂交载体的构建44-45

2.3 BiFC载体的构建45

2.4 VIGS载体的构建45-46

2.3 重组蛋白原论文导读：114-1154.6PsTRX-F在体外对PsCHLI的ATP酶活性和重组镁离子螯合酶活性具有推动作用1154.7叶绿体TRX在体内调控CHLI的氧化还原状态以及镁离子螫合酶活性115-1174.8TRX-F和TRX-M参与调控四吡咯生物合成代谢途径117-1184.9TRX-F和TRX-M参与调控PhANGs的转录1184.10总结118-122参考文献122-139附录139-157附录A部分实验的操
核表达和纯化46-48

2.3.1 6×His标签融合蛋白的原核表达与纯化46-47

2.3.2 谷胱甘肽转移酶(GST)标签融合蛋白的原核表达与纯化47-48

2.3.3 GST pull-down实验48

2.4 镁离子螫合酶活性和ATPase活性的测定48-52

2.4.1 镁离子螫合酶活性的测定48-50

2.4.2 ATP酶活性的测定50-52

2.5 酵母双杂交实验52

2.6 双分子荧光互补实验52-53

2.7 豌豆VIGS实验53

2.8 豌豆VIGS植株叶片中各种生理生化指标的测定53-56

2.8.1 色素含量的测定53-54

2.8.2 血红素含量的测定54

2.8.3 5-氨基乙酰丙酸合成速率的测定54-55

2.8.4 光合作用相关参数F_v/F_m的测定55

2.8.5 叶片中活性氧物质的测定55-56

2.8.6 叶片中抗氧化酶活性的检测56

2.9 豌豆VIGS植株叶片的代谢组学浅析56

2.10 豌豆VIGS植株叶片中基因表达浅析56-58

2.10.1 转录水平浅析56-57

2.10.2 蛋白质水平浅析57-58

2.11 镁离子螯合酶Ⅰ亚基在体内的氧化还原状态浅析58-59

2.12 显微镜浅析59-60

2.11 共聚焦激光显微镜浅析59

2.12 透射电子显微镜浅析59

2.13 荧光显微镜浅析59-60

2.13 PsCHLI基因拷贝数浅析60-62

2.13.1 基因组DNA的提取60-61

2.13.2 Southern-blot浅析61-62

2.14 序列浅析62-63

3 结果与浅析63-111

3.1 豌豆镁离子螯合酶Ⅰ亚基结构和功能浅析63-73

3.

1.1 豌豆镁离子螯合酶Ⅰ亚基cDNA和氨基酸序列浅析63-69

3.

1.2 PsCHLI中负责相互作用和酶活性的功能域69-73

3.2 病毒介导的豌豆PsCHLI和PsCHLD基因沉默植株的探讨73-94
3.

2.1 PsCHLI和PsCHLD基因沉默植株呈现黄化表型73-76

3.2.2 VIGS-CHLI和VIGS-CHLD植株叶片中生理生化指标的变化76-79
3.

2.3 VIGS植株叶片中叶绿体结构和功能的变化79-85

3.

2.4 VIGS植株叶片中活性氧物质积累情况85-88

3.

2.5 VIGS植株叶片代谢组学浅析88-90

3.

2.6 VIGS植株叶片中光合作用相关的核基因表达变化90-94

3.3 叶绿体硫氧还蛋白对镁离子螫合酶活性调控的探讨94-111

3.1 CHLI、CHLD、CHLH和GUN4与TRX-F相互作用的探讨94-97

3.3.2 PsTRXF对PsCHLI的体外ATP酶活性以及重组的镁离子螯合酶活性的影响97-99

3.3 病毒介导的PsTRXs基因沉默植株表型探讨99-102

3.4 VIGS植株叶片中PsCHLI氧化还原状态的探讨102-105

3.5 VIGS-TRX植株叶片中生理生化指标的变化105-108

3.6 VIGS-TRX植株叶片中PhANGs的表达情况108-111

4 讨论111-122
4.1 镁离子螯合酶活性降低引起植株生理生化以及叶绿体结构和功能等多效性变化111-112

4.2 镁离子螯合酶参与协调叶绿体和线粒体中代谢途径间的相互作用112-113

4.3 镁离子螯合酶活性降低导致细胞内ROS的积累113

4.4 CHLD反馈调控PhANGs的转录113-114

4.5 镁离子螯合酶参与调控光合作用相关蛋白在体内的稳定性114-115

4.6 PsTRX-F在体外对PsCHLI的ATP酶活性和重组镁离子螯合酶活性具有推动作用115
4.7 叶绿体TRX在体内调控CHLI的氧化还原状态以及镁离子螫合酶活性115-117

4.8 TRX-F和TRX-M参与调控四吡咯生物合成代谢途径117-118

4.9 TRX-F和TRX-M参与调控PhANGs的转录118

4.10 总结118-122

参考文献122-139
附录139-157
附录A 部分实验的操作流程139-151
附录B 附表151-155
附录C 简历及攻读期成果155-157
致谢157