研究聚糖产β-mannanase内生菌诱变育种和酶学特性

论文导读：H对发酵产酶的影响352.8.3培养温度对发酵产酶的影响352.8.4摇床转速对发酵产酶的影响352.8.5发酵条件正交试验352.8.6补料对UD-20发酵产酶的影响35-362.8.7静置培养对发酵产酶的影响362.9Β-甘露聚糖酶酶学性质探讨36-382.9.1温度对β-甘露聚糖酶的影响362.9.2pH对β-甘露聚糖酶的影响362.9.3金属离子对β-甘露
摘要：β-甘露聚糖酶（β-mannanase）又叫β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanmannanohydrolase,EC3.2.1.78），是一种半纤维素酶，能够随机水解β-l,4-甘露糖苷键的内切水解酶。已经被广泛运用于造纸、食品、饲料、纺织、印染、石油开采以及洗涤剂行业等诸多领域，成为一种极其重要的工业酶制剂。但就我国而言，由于受高成本和低产量的限制，β-甘露聚糖酶的探讨大部分仍然处于实验室阶段，无法大批量、大规模生产，由此选育高产β-甘露聚糖酶菌株成了本探讨努力的方向。本实验以筛选的一株产β-甘露聚糖酶的黄豆内生菌BacillussubtipsHD-1出发，比较了紫外线诱变，硫酸二乙酯诱变，紫外线-光复活诱变以及紫外线-硫酸二乙酯复合诱变，确定最佳诱变案例为紫外线-硫酸二乙酯复合诱变：先用20W紫外灯于30cm出照射6min，再用1.6%的硫酸二乙酯处理40min。获得一株高产突变菌株BacillussubtipsUD-20，发酵酶活达89.5U/ml，比出发菌株提升了63.9%，传代7次其遗传性能稳定，命名为BacillussubtipsUD-20。通过对BacillussubtipsUD-20的发酵培养基和发酵条件优化，确定最佳产酶条件为：魔芋精粉30g/L，蛋白胨3g/L，3g/L，氯化钙3.0mmol/L，氯化镁2.0mmol/L，氯化钡0.2mmol/L，吐温801.0g/L，甘氨酸0.2g/L(于发酵进行10h左右向发酵培养基中添加)，2%的接种量，pH7.0，35℃，180r/min发酵培养72h，DNS法测得酶活最高为213.6U/ml。在此基础上进行摇瓶补料发酵，酶活高达275.1U/ml，较未补料酶活提升了34%，是出发菌株的5.0倍，另外，静置培养酶活也比常规发酵提升了24.5%。β-甘露聚糖酶酶学特性浅析显示，该酶的最适温度和pH分别为50℃和7.0，该酶在50℃以下，pH5.0-8.0之间稳定性较好。2.0mmol/L的钙、镁、铁、钴离子和0.2mmol/L的钾、钙、铜、镍离子对酶有激活作用，其中以2.0mmol/L的铁和钴离子的激活作用最强，相对酶活分别提升了13.2%和31.7%，但是2mmol/L的锰离子对酶活有极强的抑制作用，酶活仅有对照组的55.6%；2.0mmol/L的钾、钙、镍、钴、钡离子和0.2mmol/L的镍离子能够增强酶热稳定性，其中以2.0mmol/L的钴离子的增强效果最为显著，残余酶活是对照组的1.48倍，但是在2.0mmol/L的锰离子作用下，残余酶活力仅有对照组的59.4%。β-甘露聚糖酶对葡甘露聚糖、瓜尔豆胶和槐豆胶的Km和Vmax值分别为10.9、15.6、33.4mg/ml和9960.2、526.3、769.2U/ml，较低的Km和较高的Vmax显示β-甘露聚糖酶的最适反应底物为葡甘露聚糖，酶解葡甘露聚糖的酶活为6116.6U/ml，是酶解槐豆胶的22.2倍，酶解瓜尔豆胶的28.2倍，酶解槐豆胶多为甘露寡糖。植物内生菌BacillussubtipsUD-20所产的β-甘露聚糖酶可以运用于食品、饲料、保健品等行业。关键词：内生菌论文β-甘露聚糖酶论文葡甘露聚糖论文静置培养论文底物特异性论文
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ABSTRACT6-12
第一章 前言12-28

1.1 甘露聚糖12

1.2 Β-甘露聚糖酶12-22

1.2.1 β-甘露聚糖酶的概述12-14

1.2.2 β-甘露聚糖酶的来源14

1.2.3 β-甘露聚糖酶的性质14-19

1.2.4 β-甘露聚糖酶的微生物发酵进展19-22

1.3 内生菌22-23

1.3.1 内生菌的概述22

1.3.2 内生菌的多样性22-23

1.3.3 产β-甘露聚糖酶内生菌的探讨23

1.4 β-甘露聚糖酶产生菌诱变育种23-26

1.5 本课题的探讨作用和技术路线26-28

1.5.1 本课题的探讨作用26

1.5.2 本课题的技术路线26-28

第二章 材料与策略28-38

2.0 出发菌株28

2.1 培养基28

2.2 主要生化试剂28-29

2.3 主要仪器和设备29

2.4 主要试剂的制备29

2.4.1 配制 DNS 试剂29

2.4.2 制备缓冲液29

2.5 酶活测定29-30

2.5.1 绘制标准曲线29

2.5.2 粗酶液的制备29-30

2.5.3 DNS 法测酶活30

2.5.4 酶活定义30

2.6 Β-甘露聚糖酶高产菌株选育30-33

2.6.1 出发菌株生长曲线30-31

2.6.2 出发菌株菌悬液的制备31

2.6.3 紫外线诱变31

2.6.4 硫酸二乙酯诱变31-32

2.6.5 紫外线-光复活诱变32

2.6.6 紫外线-硫酸二乙酯复合诱变32-33

2.6.7 β-甘露聚糖酶高产突变菌株初筛33

2.6.8 β-甘露聚糖酶高产突变菌株复筛33

2.6.9 高产突变菌株遗传稳定性实验33

2.7 发酵培养基的优化33-34

2.7.1 碳源对发酵产酶的影响33

2.7.2 氮源对发酵产酶的影响33-34

2.7.3 金属离子和吐温 80 对发酵产酶的影响34

2.7.4 氨基酸和维生素对发酵产酶的影响34

2.8 发酵条件的优化34-36

2.8.1 接种量与发酵时间发酵产酶的影响34-35

2.8.2 培养基初始 pH 对发酵产酶的影响35

2.8.3 培养温度对发酵产酶的影响35

2.8.4 摇床转速对发酵产酶的影响35

2.8.5 发酵条件正交试验35

2.8.6 补料对 UD-20 发酵产酶的影响35-36

2.8.7 静置培养对发酵产酶的影响36

2.9 Β-甘露聚糖酶酶学性质探讨36-38

2.9.1 温度对β-甘露聚糖酶的影响36

2.9.2 pH 对β-甘露聚糖酶的影响36

2.9.3 金属离子对β-甘露聚糖酶的影响36-论文导读：异性372.9.5β-甘露聚糖酶动力学常数的测定372.9.6β-甘露聚糖酶酶解产物浅析37-38第三章结果与浅析38-583.1Β-甘露聚糖酶高产菌株选育38-423.1.1出发菌株生长曲线383.1.2紫外线诱变结果38-393.1.3硫酸二乙酯诱变结果39-403.1.4紫外线-光复活诱变结果40-413.1.5紫外线-硫酸二乙酯复合诱变结果41-423.1.6高产突变菌
37

2.9.4 β-甘露聚糖酶底物特异性37

2.9.5 β-甘露聚糖酶动力学常数的测定37

2.9.6 β-甘露聚糖酶酶解产物浅析37-38

第三章 结果与浅析38-58

3.1 Β-甘露聚糖酶高产菌株选育38-42

3.

1.1 出发菌株生长曲线38

3.

1.2 紫外线诱变结果38-39

3.

1.3 硫酸二乙酯诱变结果39-40

3.

1.4 紫外线-光复活诱变结果40-41

3.

1.5 紫外线-硫酸二乙酯复合诱变结果41-42

3.

1.6 高产突变菌 Bacillus subtipsUD-20 株遗传稳定性42

3.2 BACILLUS SUBTILISUD-20 发酵培养基的优化42-47
3.2.1 碳源对 Bacillus subtipsUD-20 发酵产酶发酵产酶的影响42-43
3.3.2 氮源对 Bacillus subtipsUD-20 发酵产酶的影响43-44
3.2.3 金属离子和吐温 80 对 Bacillus subtipsUD-20 发酵产酶的影响44-46
3.2.4 氨基酸和维生素对 Bacillus subtipsUD-20 发酵产酶的影响46-47

3.3 BACILLUS SUBTILIS UD-20 发酵条件优化47-52

3.3.1 接种量对 Bacillus subtips UD-20 发酵产酶的影响47-48
3.3.2 培养基初始 pH 对 Bacillus subtipsUD-20 发酵产酶的影响48
3.3.3 培养温度对 Bacillus subtipsUD-20 发酵产酶的影响48-49

3.4 摇床转速对 Bacillus subtipsUD-20 发酵产酶的影响49

3.5 Bacillus subtipsUD-20 发酵条件正交试验49-50

3.3.6 摇瓶补料对 Bacillus subtips UD-20 发酵产酶的影响50-51

3.7 静置培养对发酵产酶的影响51-52

3.4 Β-甘露聚糖酶酶学特性探讨52-58

3.4.1 温度对β-甘露聚糖酶的影响52-53

3.4.2 pH 对β-甘露聚糖酶的影响53

3.4.3 金属离子对β-甘露聚糖酶的影响53-55

3.4.4 β-甘露聚糖酶底物特异性55

3.4.5 β-甘露聚糖酶动力学常数的测定55-56

3.4.6 β-甘露聚糖酶解产物浅析56-58

结论58-60
参考文献60-70
致谢70-72
攻读学位期间发表的论文72-73