简论硝基苯NF-κBp65反义寡核苷酸对TNBS诱导小鼠慢性肠纤维化影响及治疗观察设计

论文导读：和浆膜层，固有肌层显著增厚。TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组炎症评分及纤维化评分较正常组、ASONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组高（P0.05）；ASONDⅠ、Ⅲ组炎症评分及纤维化评分较正常组、ASONDⅡ组高（P0.05），而ASONDⅡ组炎症评分只较正常组高（P0.05）。ASONDⅡ组纤维化评分与正常组相比无统计学作用（P0.05）

3.TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠结肠组织

摘要：探讨背景：炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种胃肠道慢性非特异性炎症性疾病，包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），该病的发病率及患病率在全球均报道有上升，与之相关的大肠癌发病率也越来越高，给人们的健康造成了很大危害。传统以及新型的治疗炎症性肠病的药物其疗效及安全性不尽如人意，而长期慢性肠道炎症导致纤维化并形成肠梗阻，即使行外科手术切除后肠炎或细胞外基质转变导致的肠纤维化和狭窄仍可再次发生。探讨表明，在右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）、三硝基苯磺酸（TNBS）等诱发的结肠炎均发现NF-κB起关键性作用，由此，NF-κB己经成为目前探讨及开发治疗IBD新药物的靶标。目的：探讨NF-κBp65反义寡核苷酸(antisense phosphorothioate opgodeoxynucleotide,ASOND)灌肠对TNBS诱导BALB/C小鼠慢性肠纤维化的影响，并探讨NF-κBp65ASOND用药的最佳时间点。通过观察各组小鼠的健康情况，浅析结肠组织学病理变化、胶原纤维增生程度、IL-1β、TNF-α、Col-Ⅲα1mRNA的表达以及NF-κBp65、TGF-β1的蛋白表达水平，来探讨NF-κBp65ASOND在治疗肠纤维化中的作用，进而探讨NF-κBp65ASOND的作用机制，为寻找一种具有开发潜力的治疗IBD的新药物提供实验依据，为IBD治疗开辟一条新的途径。策略：将体重约19-23克BALB/C雌性小鼠随机分成8组，每组12只，分别为正常对照组（简称正常组）、TNBS模型组（简称TNBS组）、NF-κBp65错义寡核苷酸阴性对照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组（简称MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组）、NF-κBp65反义寡核苷酸治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组（简称ASONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组）。正常组每周给予生理盐水100ul灌肠2次，连续6周；TNBS组连续6周2mgTNBS/50%酒精100ul灌肠，灌TNBS前一天给予生理盐水100ul灌肠；MSONDⅠ组及ASONDⅠ组连续6周2mgTNBS/50%酒精100ul灌肠，第1、2周灌TNBS前一天分别给予MSOND及ASOND100ul灌肠，后4周灌TNBS前一天给予生理盐水100ul灌肠；MSONDⅡ组及ASONDⅡ组连续6周2mgTNBS/50%酒精100ul灌肠，第3、4周灌TNBS前一天分别给予MSOND及ASOND100ul灌肠，其余4周灌TNBS前一天给予生理盐水100ul灌肠；MSONDⅢ组及ASONDⅢ连续6周2mgTNBS/50%酒精100ul灌肠，第5、6周灌TNBS前一天分别给予MSOND及ASOND100ul灌肠，其余4周灌TNBS前一天给予生理盐水100ul灌肠。所有组别小鼠于最后一次灌肠后1周处死，取结肠组织，并通过HE染色评估小鼠结肠组织的炎症程度、VG染色评估小鼠肠道纤维化程度、RT-PCR检测IL-1β、TNF-α及Col-Ⅲα1mRNA的表达、免疫组织化学检测小鼠结肠组织NF-κBp65及TGF-β1的蛋白表达水平。结果：1. TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠每次TNBS灌肠后即出现不同程度的症状，且上面陈述的症状逐渐加重，第3－4天后开始逐渐减轻，前3周症状最重，在随后的3周症状较前减轻。ASONDⅠ组小鼠第1、2周TNBS灌肠后症状较除正常组外各组程度更轻，第3周症状较前两周加重，但仍较正常组之外各组更轻，第4周仍有加重走势，第5周开始逐渐减轻；ASONDⅡ组小鼠TNBS灌肠后第1、2周症状较显著，以第3周开始程度减轻；ASONDⅢ组小鼠TNBS灌肠后前3周症状较显著，以第4周开始减轻，且第4、5周减轻较显著；而正常组无显著上面陈述的症状。2.肉眼观察TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠结肠标本，可见充血、水肿，病变处结肠僵硬、扭曲、变形，致部分肠段狭窄，小部分小鼠结肠标本可见PP淋巴结增大、肠管粘连；而ASONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组各组小鼠结肠组织充血、水肿等体现较TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组轻，且肠管无显著的狭窄、变形等，其中ASONDⅡ组程度最轻。病理观察除正常组之外其余各组小鼠结肠均可见不同程度的肠道炎症体现及肠道纤维化体现，如结肠组织固有层可见炎症细胞浸润、杯状细胞数量减少、腺体破坏、上皮细胞破碎；结肠组织镜下可见大量的胶原蛋白沉淀于粘膜下层和浆膜层，固有肌层显著增厚。TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组炎症评分及纤维化评分较正常组、ASONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组高（P0.05）；ASONDⅠ、Ⅲ组炎症评分及纤维化评分较正常组、ASONDⅡ组高（P0.05），而ASONDⅡ组炎症评分只较正常组高（P0.05）。ASONDⅡ组纤维化评分与正常组相比无统计学作用（P0.05）3. TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠结肠组织中的IL-1β、TNF-α、Col-Ⅲα1mRNA较正常组、ASONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组高（P0.05）；ASONDⅠ、Ⅲ组小鼠结肠组织中的IL-1β、TNF-α、Col-Ⅲα1mRNA较正常组、ASONDⅡ组高（P0.05），ASONDⅡ组小鼠结肠组织中的IL-1β、TNF-α mRNA只较正常组高，而ASONDⅡ组小鼠结肠组织中的Col-Ⅲα1与正常组相比无统计学作用（P0.05）。4. TNBS组、MSONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组小鼠结肠组织中的NF-κB p65、TGF-β1蛋白表达较正常组、ASONDⅠ、Ⅱ、Ⅲ组高（P0.05）；ASONDⅠ、Ⅲ组小鼠结肠组织中的NF-κBp65、TGF-β1蛋白表达较正常组、ASONDⅡ组高（P0.05），而ASONDⅡ组小鼠结肠组织中的NF-κBp65、TGF-β1蛋白表达只较正常组高（P0.05）。结论：1.通过对TNBS组小鼠的健康情况、结肠大体标本、结肠病理、结肠纤维化程度的观察，证实TNBS成功诱导了慢性肠纤维化动物模型的建立。2. NF-κBp65ASOND通过下调促炎因子TNF-a、IL-1β、Col-Ⅲα1的mRNA表达及NF-κBp65、T论文导读：
GF-β1蛋白表达，来减轻小鼠结肠的炎症及纤维化程度，NF-κBp65ASOND有望成为治疗IBD的新型有效治疗药物。而NF-κBp65MSOND对小鼠结肠的炎症及纤维化无上面陈述的作用。3. NF-κBp65ASOND用药2周抑制小鼠结肠炎症及纤维化有效，但是干预的时间点不同，效果也不同，其中第3、4周用药效果为佳。关键词：炎症性肠病论文三硝基苯磺酸论文肠道纤维化论文NF-κBp65反义寡核苷酸论文治疗论文
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ABSTRACT6-13
第1章 引言13-15
第2章 材料与策略15-26

2.1 材料15-16

2.

1.1 实验动物15

2.

1.2 试剂和药品15-16

2.

1.3 主要仪器16

2.2 实验策略16-24

2.1 主要溶液的配制16-18

2.2 各组小鼠处理策略18-19

2.3 各组小鼠的健康情况19

2.4 各组小鼠的标本采集及处理19

2.5 HE 染色观察各组小鼠结肠病理：19-20

2.6 VG 染色评估各组小鼠结肠纤维化程度：20

2.2.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测结肠组织中 TNF-α、IL-1β、Col-Ⅲα1mRNA 表达20-24

2.8 免疫组织化学检测结肠组织NF-κBp65蛋白和TGF-β1蛋白的表达24

2.3 统计浅析策略24-26

第3章 结果26-38

3.1 各组小鼠的健康情况和存活率26-27

3.2 各组小鼠结肠组织的大体观察及病理体现27-30

3.

2.1 大体观察各组小鼠结肠组织的肉眼下体现27-28

3.

2.2 镜下观察各组小鼠结肠组织 HE 染色28-30

3.3 结肠组织 VG 染色镜下体现30-32
3.4 各组小鼠结肠 TNF-α、IL-1β、Col-Ⅲα1mRNA 的表达水平32-34

3.5 各组小鼠结肠组织中 NF-κBp65 蛋白表达的情况34-36

3.6 各组小鼠结肠组织中 TGF-β1蛋白表达的情况36-38

第4章 讨论38-45

4.1 造模策略的选择38-40

4.2 细胞因子与 IBD40-41

4.3 Ⅲ型胶原蛋白与肠纤维化41-42

4.4 NF-κBp65 反义寡核苷酸42-43

4.5 NF-κB p65 反义寡核苷酸治疗时间点的选择43-45

第5章 结论与展望45-46
致谢46-47
参考文献47-51
攻读学位期间的探讨成果51-52
综述52-59
参考文献56-59