浅议日本榧树果实中抑制人妇科肿瘤细胞增殖活性成分及其作用机制-

论文导读：种红豆杉科植物，其种子有很强的杀虫活性，在我国和朝鲜用于治疗绦虫感染，在日本民间用作流产药。关于日本榧树的化学成分探讨主要集中在它的叶子和心材上，其根供药用，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效。本实验以人子宫内膜癌细胞株(HEC-1)、人子宫颈癌细胞株(HeLa)、人卵巢囊腺癌细胞株(HAC-2)、人卵巢透明癌细胞株(HOC-21)和
摘要：目的：日本榧树(Torreya nucifer L.)是日本、朝鲜和中国特有的一种红豆杉科植物，其种子有很强的杀虫活性，在我国和朝鲜用于治疗绦虫感染，在日本民间用作流产药。关于日本榧树的化学成分探讨主要集中在它的叶子和心材上，其根供药用，具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效。本实验以人子宫内膜癌细胞株(HEC-1)、人子宫颈癌细胞株(HeLa)、人卵巢囊腺癌细胞株(HAC-2)、人卵巢透明癌细胞株(HOC-21)和人卵巢透明癌细胞株(SHIN-3)为材料，探讨日本榧树果实中纯化得到的3种二萜类化合物(18-羟基弥罗松酚、kayadiol和花柏酚)对这5种妇科肿瘤细胞增殖的抑制作用，并以HEC-1细胞为代表，进一步探讨kayadiol抑制HEC-1细胞增殖的作用机制。策略：1MTT(四偶氮唑蓝)比色法1.1肿瘤细胞株悬液制备用RPMI-1640完全培养基调整实验用肿瘤细胞株浓度为2×105个/mL的细胞悬液备用。1.2体外抑瘤实验取对数生长期的实验用肿瘤细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50μL(含1×104个细胞)，分别加入溶剂对照(终浓度0.1%DMSO)、阳性对照(顺铂)和终浓度为1、10和100μmol/L的5种二萜类化合物各50μL，每组均设3个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养44h，然后各孔加入5mg/mL的MTT10μL。培养4h后，弃去培养孔中上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，充分溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD值)，并计算肿瘤细胞存活率，细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。实验数据用The SPSS system V13.0软件进行处理，受试药物对细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合，计算药物的半数抑制浓度(IC50)值。2凋亡细胞原位标记与半定量浅析取对数生长期的HEC-1细胞，将细胞悬浮接种于8孔Chamber spde，每孔100μL(含2×10~4个细胞)，分别加入溶剂对照(终浓度0.1%DMSO)和终浓度为10μmol/L的kayadiol100μL，置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养12h和24h。采取末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测。每张切片拍摄5个阳性视野，分别计数每视野正常细胞数和带有荧光的凋论文导读：1MTT(四偶氮唑蓝)比色法结果本实验采取MTT法探讨了3种二萜类化合物(18-羟基弥罗松酚，kayadiol，花柏酚)对5种妇科肿瘤细胞增殖活性的影响。18-羟基弥罗松酚、kayadio和花柏酚对5种妇科肿瘤细胞增值活性有不同的抑制活性。其中kayadio对上面陈述的5种细胞的增殖显示强的抑制活性，1、10和100μmol/Lkayadio处理的HEC-1细胞
亡细胞数，以平均阳性细胞所占的正常细胞的百分比作为细胞凋亡率(apoptotic rate，AR)。3Western blotting检测取对数生长期的HEC-1细胞，按2×10~6个细胞/培养皿接种。加入终浓度为10μmol/L的顺铂和kayadiol的培养基，培养细胞48h，离心收集细胞，PBS漂洗细胞，加上样缓冲液100μL，剧烈震荡后冰浴下超声波处理1min。100℃加热10min使蛋白质变性，12000r/min离心10min，取上清液测定蛋白浓度。取50μg蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，电转移至硝酸纤维膜(NC膜)，用5%脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜2h。弃封闭液，用1×TBS-T洗膜3次，每次15min。膜在抗Bax多克隆抗体(1:500)和抗caspase-3多克隆抗体(1:700)稀释液中室温过夜孵育，1×TBS-T洗膜3次，每次15min，在二抗稀释液(抗鼠1:5000)中孵育40min。再次洗膜后加入ECL试剂，反应1min，用X片1-10min后，显影。4半胱天冬酶抑制剂对kayadiol抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用取对数生长期的HEC-1细胞，将细胞悬浮接种于96孔板，每孔50μL(含1×10~4个细胞)，分别加入含有半胱天冬酶抑制剂终浓度为1、10和100μmol/L kayadiol和不含半胱天冬酶抑制剂的kayadiol，各50μL，每组均设3复孔，置于培养箱中培养44h，各孔加入5mg/mL的MTT10μL。继续培养4h后，弃去培养孔中上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，充分溶解结晶，测定OD值，并计算细胞存活率。结果：1MTT(四偶氮唑蓝)比色法结果本实验采取MTT法探讨了3种二萜类化合物(18-羟基弥罗松酚，kayadiol，花柏酚)对5种妇科肿瘤细胞增殖活性的影响。18-羟基弥罗松酚、kayadio和花柏酚对5种妇科肿瘤细胞增值活性有不同的抑制活性。其中kayadio对上面陈述的5种细胞的增殖显示强的抑制活性，1、10和100μmol/L kayadio处理的HEC-1细胞，其细胞存活率分别为69.87%、39.31%和2.76%，对HeLa细胞，其存活率分别为89.87%、41.31%和6.76%，对HAC-2细胞，其存活率分别为73.56%、40.15%和17.27%，对HOC-21细胞，其存活论文导读：率分别为69.24%、43.53%和12.49%，均呈现较好的剂量依赖联系，该化合物10μmol/L组与溶剂对照组相比均具有显著性的差别(P＜0.05)，且100μmol/L组具有非常显著性的差别(P＜0.01)，IC_(50)分别为3.33μmol/L、8.00μmol/L、5.95μmol/L、7.20μmol/L和5.12μmol/L。阳性对照顺铂的IC50分别为15.91μmol/L、3

4.36μmol/L、38.34μmo

率分别为74.44%、50.90%和11.15%，对SHIN-3细胞，其存活率分别为69.24%、43.53%和12.49%，均呈现较好的剂量依赖联系，该化合物10μmol/L组与溶剂对照组相比均具有显著性的差别(P＜0.05)，且100μmol/L组具有非常显著性的差别(P＜0.01)，IC_(50)分别为3.33μmol/L、8.00μmol/L、5.95μmol/L、7.20μmol/L和5.12μmol/L。阳性对照顺铂的IC50分别为15.91μmol/L、34.36μmol/L、38.34μmol/L、44.53μmol/L和5.32μmol/L(Fig.2and Table1)。2kayadiol对HEC-1细胞凋亡原位标记与半定量浅析利用10μmol/L的kayadiol处理HEC-1细胞后，观察HEC-1细胞凋亡情况，结果显示，溶剂对照组、12h组和24h组HEC-1细胞凋亡率分别为(2.40±1.20)%、(40.16±6.84)%和(86.88±6.00)%，kayadio可显著诱导HEC-1细胞的凋亡，并呈现较好的时间依赖联系(Fig.3,Aand B)。3kayadio对HEC-1细胞内Bax和caspase-3蛋白的上调作用为了进一步探讨kayadio对HEC-1细胞内Bax和caspase-3蛋白的影响，利用10μmol/L的kayadio处理HEC-1细胞48h后，通过Western blotting策略检测细胞内Bax和caspase-3蛋白的变化。结果显示，kayadio作用HEC-1细胞48h后，细胞内的Bax和caspase-3蛋白表达显著上调(Fig.4,A, B and C)。4半胱天冬酶抑制剂对kayadio抑制HEC-1细胞增殖的翻转作用利用1、10和100μmol/L的kayadio处理HEC-1细胞，其细胞存活率分别为69.87%、39.31%和2.76%，利用20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与kayadio共同孵育HEC-1细胞后，其细胞存活率分别为80.78%、36.27%和8.98%，在浓度为1和100μmol/L的细胞细胞存活率上升显著(Fig.5)。结论：日本榧树果实中化合物能显著抑制人妇科肿瘤细胞的增殖活性；kayadio抑制HEC-1增殖活性的作用机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。诱导细胞凋亡是一论文导读：二萜类化合物的生物活性探讨近况36-49参考文献43-49致谢49-50个人简历50上一页1234
个由多信号诱导、多基因调控和多因子参与的历程，本实验验证的仅仅是诱导凋亡的通路之一，kayadio是否还通过其他通路来达到诱导凋亡的结果，还未可知。由此kayadio诱导妇科肿瘤细胞凋亡的机制还不是非常清楚，需要进一步探讨。关键词：日本榧树论文二萜类化合物论文HEC-1细胞论文增殖活性论文细胞凋亡论文
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英文摘要8-13
前言13
材料与策略13-18
结果18-22
附图22-27
附表27-28
讨论28-32
结论32
参考文献32-36
综述 二萜类化合物的生物活性探讨近况36-49
参考文献43-49
致谢49-50
个人简历50