探讨GeXP多重RT-PCR技术在病毒性脑炎病原检测中运用-经典

论文导读：
摘要：目的利用GeXP多重基因表达遗传浅析系统,建立一种能够同时检测脑炎相关的8种虫媒病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(mRT-PCR)策略,并对此策略作出初步评价。策略以脑炎相关的8种虫媒病毒为探讨对象,包括版纳病毒(Banna virus,B),乙型脑炎病毒(Japanese encephaptis virus,JEV),蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephaptis virus,TBEV), Tahyna病毒(Tahyna virus,TAHV),辽宁病毒(Liaoning virus,LNV),科萨努尔森林病病毒(Kyasanur forest disease virus,KFDV),辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)及云南环状病毒(Yunnan orbivirus,YUOV)并加入小鼠脑脊髓炎病毒(Theiler's Mouse Encephalomyeptis virus, TMEV)做为内部对照。利用GeXP系统建立多重RT-PCR检测策略,设计各病毒特异引物并进行筛选,以病毒分离培养物和阳性标本来验证引物及多重反应系统的特异性,根据PCR结果来优化多重反应系统及反应条件,构建单克隆质粒并进行体外转录并制备标准品即体外转录RNA的梯度稀释液来检测多重系统的灵敏度。用该策略对未知标本进行检测,并将检测结果与其它策略进行比较,根据比较的结果对该策略做出评价。结果筛选后的各病毒引物扩增片段大小与设计相符且特异性强,相互之间无交叉反应。优化后的多重检测系统,可扩增出各病毒对应的特异片段,可在102拷贝/μL水平同时并特异地检测出8种(共13个特异片段)脑炎相关虫媒病毒RNA。通过对37份蚊虫碾磨液提取核酸的标本检测,可看出GeXP多重检测策略特异性强,且灵敏度显著高于病毒分离及半巢式PCR。结论成功建立了一种基于GeXP的多重RT-PCR技术平台的8种脑炎相关虫媒病毒的检测新策略,该策略具有高通量、灵敏度高、特异性强且快速等优点,对病毒性脑炎的分子诊断及流行病学调查具有重要作用。关键词：GeXP系统论文病毒性脑炎论文多重RT-PCR论文
本论文由www.7ctime.com,需要论文可以联系人员哦。摘要5-6
Abstract6-11
插图或附表清单11-12
注释说明清单12-14
引言14-17
1 探讨背景17-21

1.1 GeXP系统的原理及运用17-19

1.2 病毒性脑炎探讨进展19-21

2 病毒性脑炎GeXP多重检测系统的建立21-43

2.1 试验材料21-22

2.

1.1 病毒来源21

2.

1.2 主要试剂21

2.

1.3 主要仪器耗材21-22

2.2 缓冲液及细菌培养基配置22

2.1 核酸电泳缓冲液22

2.2 细菌培养基(LB培养基)22

2.3 试验策略22-33

2.3.1 引物设计22-23

2.3.2 病毒样品处理23-24

2.3.1 病毒核酸提取前准备23

2.3.2 核酸提取23-24

2.3.3 单引物特异性验证24-25

2.3.4 构建单克隆质粒25-27

2.3.4.1 PCR产物纯化25

2.3.4.2 连接25-26

2.3.4.3 转化26-27

2.3.5 质粒的提取及线性化27-29

2.3.5.1 质粒提取27-28

2.3.5.2 提取质粒线性化28-29

2.3.6 参考品的制备29-31

2.3.6.1 体外转录RNA的制备29

2.3.6.2 体外转录后去DNA模板29-30

2.3.6.3 体外转录后去盐类及核苷酸30-31

2.3.7 多重检测系统的建立31-32

2.3.7.1 多重系统特异性验证31-32

2.3.7.2 多重系统多引物单模板灵敏度浅析32

2.3.7.3 多重系统多引物多模板灵敏度浅析32

2.3.8 GeXP多重系统验证32-33

2.4 试验结果33-43

2.4.1 引物设计33

2.4.2 单引物特异性验证33-34

2.4.3 质粒的提取及线性化34-36

2.4.4 多重系统特异性验证36-37

2.4.5 多重系统多引物单模板灵敏度结果37-40

2.4.6 多重系统多引物单模板灵敏度结果40-41

2.4.7 多重系统验证结果41-43

3 实验讨论43-45
结论45-46
参考文献46-50
附录A50-61
后记或致谢61-62
作者介绍及读研期间主要科研成果62