探讨基因芯片树木溃疡病菌多重PCR-基因芯片检测技术构建及在生态中运用

论文导读：检测到1ng的基因组DNA。芯片有效性评价上，除E.mammata外杂交11个种，靶标菌株B.dothidea，V.sordida，B.rhodina(L.peudotheobromae)能够杂交上所建立的芯片上特异性（专化性）探针，其余未杂交上靶标探针；除Ascochytasp.，其余对照菌株L.terebrantis，P.cactorum，A.bisporus，C.bertholletiae杂交结果呈阴性；通过不同浓度（1ng，0.1ng
摘要：杨树溃疡病病原种类多样，寄主广泛。无性型多样，种间形态特点有重叠；有性型不常发现，且病原的检测常受到地理、寄主、分类知识的限制，由此需要进展非依赖分离培养策略的病原鉴定和林间诊断技术。通过对多种核酸模板和具遗传标记功能的多个靶标核酸序列（基因）的扩增、测序和比对，多重PCR扩增技术及基因芯片检测技术可以直接用于环境样本的浅析。多重PCR同时平行通量扩增加个模板或位点，芯片具有同时平行通量检测多种病原菌的潜力，二者的联合可完成快速高通量并行的检测多个物种，目前对多种溃疡病病原的探讨中还没有运用多重PCR-基因芯片（ArrayTube）技术。本探讨目的虽是建立树木溃疡病快速高通量鉴定的多重PCR-基因芯片技术平台，但该技术同时能够适应于以生物种群浅析和鉴定为基础的其他林业微生物探讨与开发运用中，能有效地解决和准确的鉴定鉴别及浅析林业微生物中遇到的快速判定难题，探讨结果也为树木病害相关的病原生态学，病害流行学的探讨奠定了基础。本探讨通过病原菌种类及其发生溃疡病的严重性，核酸标记信息丰富性等浅析，选择以葡萄座球腔菌为主要检测对象，包括Valsa、Leucostoma和Entoleuca属的16个种，并通过BioEdit软件，建立了相关溃疡病病原真菌的靶标核酸序列数据库，浅析了种属间靶标序列内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）和延伸因子（ElongationFactor-1α，EF-1α）差别性，共设计出26对探针（ITS：12条；EF-1α：14条），完成ArrayTube芯片。在芯片有效性评估中，首先，搜集12种供试菌株，包括子囊菌Botryosphaeria dothidea，Botryosphaeria berengeriana；Valsa sordida，Ascochyta sp.，Botryosphaeria rhodina，Leucostoma sp.，Valsa ambiens，Entoleuca mammata，Leptographiumterebrantis；卵菌Phytophthora cactorum；担子菌Agaricus bisporus；接合菌Cunninghamellabertholletiae。将菌株进行活化培养，提取DNA，选择不同引物（生物素标记）进行单一ITS和EF-1α的PCR和多重PCR扩增；其次，设置不同靶标种属及靶标序列不同浓度对芯片的专化性和灵敏度进行验证；最后，将有效化评估后的多重PCR-ArrayTube芯片技术运用于环境样本中，即以北京12个区县调查点的杨树为对象（24个样本包括12个感病，12个健康），直接提取环境样本总DNA多重PCR扩增之后进行芯片杂交，并以克隆为辅助手段进行芯片检测结果的偏差性验证。探讨还就有关病原菌种群多样性伴随的内生菌区系进行了初步的浅析。结果表明：对于溃疡病病原菌的探讨，经过优化，选择真菌通用引物ITS1/ITS4和EF1-728F/EF1-986R，退火温度为55.6℃，各引物终浓度为0.2μM，建立的多重PCR扩增ITS和EF-1α系统，可以成功地扩增出室内供试菌株和环境样本真菌的目的条带。并通过测序比对鉴定出多种来自培养和环境病害组织中的溃疡病病菌，多重PCR能够检测到1ng的基因组DNA。芯片有效性评价上，除E.mammata外杂交11个种，靶标菌株B.dothidea，V.sordida，B.rhodina(L.peudotheobromae)能够杂交上所建立的芯片上特异性（专化性）探针，其余未杂交上靶标探针；除Ascochyta sp.，其余对照菌株L.terebrantis，P.cactorum，A.bisporus，C.bertholletiae杂交结果呈阴性；通过不同浓度（1ng，0.1ng，0.01ng）的多重PCR产物模板探讨，表明芯片灵敏度可检出0.1ng的靶标核酸含量。通过对来自北京不同区县的24个样本芯片检测测试表明，芯片能有效直接检测出感病和健康样本中的B.dothidea、V.sordida，与样本的克隆测序得到的结果基本吻合。结合芯片检测环境样本，对采集到的杨树组织环境样本进行了分离纯化、形态鉴定和序列浅析后，得到了子囊菌和担子菌；其中Botryosphaeria spp.论文导读：联系人员哦。摘要5-7Abstract7-15第一章绪论15-291.1引言15-261.1.1病原微生物检测技术探讨16-231.1.2杨树溃疡病探讨和探讨策略进展23-261.2探讨目标和主要探讨内容26-281.2.1关键的科学不足与探讨目标26-271.2.2主要探讨内容271.2.3探讨革新点27-281.3探讨技术路线
，Valsa spp.为优势菌，此外还有菌群Coniothyrium spp.、Fusarium spp.、Peyronellaea spp.、Hyalodendriella spp.、Alternaria spp.、Lecanicilpum lecanii、Leucostoma niveum、Meyerozyma guilpermondii、Colletotrichumgloeosporioides、Schizophyllum commune、Funapa trogii，其中有些菌作为内生菌有着，这为多重PCR-基因芯片的开发以及在病原菌与内生菌联系，病原菌与寄主互作联系以及森林病原菌微生物生态学方面的运用奠定了基础。关键词：树木溃疡病论文多重PCR论文基因芯片论文ArrayTube论文病原鉴定论文环境样本论文
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Abstract7-15
第一章 绪论15-29

1.1 引言15-26

1.1 病原微生物检测技术探讨16-23

1.2 杨树溃疡病探讨和探讨策略进展23-26

1.2 探讨目标和主要探讨内容26-28

1.2.1 关键的科学不足与探讨目标26-27

1.2.2 主要探讨内容27

1.2.3 探讨革新点27-28

1.3 探讨技术路线28-29

第二章 树木溃疡病多重PCR-基因芯片构建与评估29-52

2.1 材料与策略29-36

2.

1.1 材料29-32

2.

1.2 策略32-36

2.2 结果与浅析36-50

2.1 普通PCR扩增36-38

2.2 多重PCR温度参数优化38-39

2.3 多重PCR引物浓度的优化39-40

2.4 多重PCR 灵敏度验证40

2.5 普通PCR和多重PCR比较40-42

2.6 AT芯片42

2.7 芯片专化性验证42-50

2.8 芯片灵敏度验证50

2.3 小结50-52

第三章 北京地区杨树溃疡病菌多重PCR基因芯片检测52-61

3.1 材料与策略52-54

3.

1.1 材料52-53

3.

1.2 策略53-54

3.2 结果与浅析54-60
3.

2.1 环境样本DNA提取54-55

3.

2.2 模拟环境带菌样本普通PCR和多重PCR扩增55-56

3.

2.3 北京地区环境样本多重PCR扩增56-57

3.

2.4 环境样本芯片杂交57-59

3.

2.5 克隆测序59-60

3.3 小结60-61
第四章 北京地区杨树溃疡病病原种群调查61-67

4.1 材料与策略61-63

4.

1.1 材料61-62

4.

1.2 策略62-63

4.2 结果与浅析63-66
4.

2.1 不同地区真菌分离和鉴定63-64

4.

2.2 序列浅析64-65

4.

2.3 不同地点分离菌株多样性分布65-66

4.3 小结66-67
第五章 结论与讨论67-75

5.1 结论67-68

5.

1.1 多重PCR系统及基因芯片检测系统的构建67-68

5.

1.2 杨树树体内病原菌和内生菌鉴定和区系浅析68

5.2 讨论68-73
5.

2.1 多重PCR优化68-70

5.

2.2 基因芯片及杂交70-71

5.

2.3 环境样本直接克隆测序71-72

5.

2.4 北京地区杨树溃疡病病原真菌区系浅析72-73

5.3 展望73-75
参考文献75-85
附录85-96
在读期间的学术探讨96-97
致谢97-98
摘要98-101
Abstract101-103