阐述CT45-5在DNA损伤应答中作用探讨-

论文导读：
摘要：肿瘤-睾丸抗原45-5(Cancer/testis antigen family45, member A5)是Chen等利用大量平行测序技术和癌/睾丸限制性mRNA表达模型鉴定出的CT抗原基因，这种策略发现了超过20种CT或者CT样基因，其中包括CT45。CT45位于X染色体着丝粒末端Xq26.3，其中包括6个几乎相同的基因拷贝。CT45-5基因全长为567bp，编码189个氨基酸。本课题组先前利用基因芯片技术进行基因差别表达浅析显示随着FHIT基因的高表达，有一系列基因的表达也出现上调，其中CT45-5的上调最为显著，对其进行了RNA水平和蛋白水平的验证，并且制备了多克隆抗体。我们前期的探讨发现Fhit-/-细胞对DNA损伤诱导剂具有更强的耐受性，为了进一步探讨CT45-5和Fhit之间的联系以及CT45家族在DNA损伤应答中的作用，本课题首先根据CT45-5基因序列，通过生物信息学的策略对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测，以中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA，将其克隆到siRNA表达载体pSilencer2.1-U6Hygro中，筛选得到阳性克隆，序列浅析得到一条正确的CT45-5-siRNA。用构建成功的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit(过表达Fhit的HeLa细胞，3-18)，Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit内源性CT45-5以及外源FHIT基因表达的干扰效果，结果显示该siRNA对CT45-5基因具有显著的干扰作用，并且FHIT基因表达也被抑制，提示CT45-5与Fhit可能有着某种功能上的联系。随后，我们对靶向CT45-5基因的siRNA的功能进行了探讨。通过细胞周期实验，证明了在对细胞进行辐射后，转染靶向CT45-5基因的siRNA的细胞出现了显著的G2期延迟现象；通过MTT实验，我们证明了在DNA损伤诱导剂处理的情况下，用靶向CT45-5基因的siRNA表达质粒与空载体分别转染过表达Fhit的HeLa细胞(3-18)，前者对DNA损伤诱导剂具有更强的耐受性，而转染没有Fhit表达的HeLa细胞则不受DNA损伤诱导剂的影响。实验结果提示我们靶向CT45-5基因的siRNA在细胞中可能通过抑制Fhit的表达，以而提升细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性。本实验通过对CT45-5基因的siRNA表达质粒的探讨，得到了一条CT45-5-siRNA，为进一步探讨Fhit及CT45-5在DNA损伤应答中的作用机制奠定了基础。关键词：CT45-5论文FHIT论文DNA损伤应答论文siRNA论文
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Abstract8-10
缩略词表10-11
第一章 引言11-25
1 CT 抗原的概述11-13
2 CT45 的探讨情况13-14
3 FHIT 的探讨情况14-17
4 siRNA 的探讨情况和前景17-20
5 MTT 比色法和流式细胞术介绍20-21
6 DNA 损伤应答概述及探讨前景21-23
7 CT45 在 DNA 损伤应答中作用的探讨作用23-24
8 CT45 的探讨展望24-25
第二章 靶向 CT45-5 基因的 siRNA 表达载体的构建25-31
材料与策略25-28
1 材料25-26
2 实验策略26-28
结果与浅析28-30
1 靶向 CT45-5 的 siRNA 的设计和筛选28-29
2 CT45-5-siRNA 载体的测序结果29-30
讨论30-31
第三章 靶向 CT45-5 的 siRNA 对 CT45-5 和 FHIT 基因表达的影响31-38
材料与策略31-36
1 材料31-32
2 实验策略32-36
结果与浅析36-37
讨论37-38
第四章 CT45-5 在 DNA 损伤应答中的作用探讨38-44
材料与策略38-39
1 材料38-39

1.1 细胞株38

1.2 试剂38

1.3 实验仪器38-39

2 实验策略39

2.1 MTT 比色法测定细胞存活率39

2.2 流式细胞术检测辐射后细胞周期39

结果与浅析39-42
1 MTT 实验结果与浅析39-41
2 流式细胞术检测结果与浅析41-42
讨论42-44
第五章 结论44-45
参考文献45-49
攻读硕士期间发表和投稿文章49-50
致谢50