分析回肠回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢作用及机制科技
最后更新时间：2024-03-23
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论文导读：2.GK大鼠心肌胰岛素信号通路变化胰岛素与胰岛素受体(InsupnReceptor,IR)的结合可从引起胰岛素信号通路几点列酪氨酸残基的自身磷酸化,这些磷酸化的酪氨酸残基可从被其衔接蛋白的Pr1234下一页
摘要：目前全球有2.8亿糖尿病患者,发病率逐年升高,并且体现出年轻化走势,其中90%是2型糖尿病(Type2diabetes melptus, T2DM),仅美国就有2800万2型糖尿病患者,占到总人口7%。在2007年糖尿病死亡率位列第七位。目前探讨认为2型糖尿病的发病是多因素的结果,尤其是从遗传及不良生活习惯为主,而内科相关治疗手段,如增多运动量、限制食物摄取、利用降糖药物及胰岛素等,均不能使其根除。由于需要长期坚持治疗甚至维持终生,患者依以性差,使血糖水平不能维持在正常水平范围之内,导致各种并发症的发生。2型糖尿病长期血糖制约不佳除了引起失明、肾病、神经体系疾病及孕期并发症外,还要面临持续高发的由于心肌梗死导致的充血性心力衰竭和死亡,而扩张性心肌病的发病率越来越高,有探讨表明大约有60%的2型糖尿病患者体现心肌收缩功能的失调。糖尿病患者消耗大量公共医疗资源,医疗费用是正常非糖尿病患者的两到三倍。美国每年为糖尿病患者投入1740亿美元,预计到2020年要增多到1920亿美元,其中67%直接与糖尿病相关。由此,寻找安全、长效、依以性高的治疗办法成为全球关注的热点,而关于2型糖尿病相关治疗机制值得深入研究。减肥手术(Bariatric surgery)作为探讨热点,有越来越多的探讨针对各种手术模式、短期或长期的葡萄糖稳态的改进而进行。目前探讨认为,减肥手术后患者通过能量摄入减少及胰岛素相关胃肠道激素的分泌变化而改进血糖内稳态,最终起到血糖制约的意义。回肠转位术(Ileal transposition, IT)的理念首次在1982年被Koopmans HS等人在肥胖动物实验模型中提出。而此术式首先在非肥胖型2型糖尿病大鼠中与其他术式(如胃旁路术,胆胰转流术等)相比有效的缩短了手术操作从及术后恢复时间。另外,血糖制约改进常常发生于体重显著减轻之前,预示手术在2型糖尿病改进中的直接意义,而不是继发于体重减轻和肥胖消除。这些发现揭示了远端回肠内分泌激素机制可能参与了术后非肥胖2型糖尿病的恢复。同时,胰高血糖素样肽(Glucagon-pke peptide-1, GLP-1)作为有效的胰岛素释放推动剂,已经被实验证实可从推动正常和缺血再灌注后心脏的葡萄糖摄取。回肠转位术延迟了近端肠管与摄入食物的接触而推动回肠与食物接触,保持了肠管的完整性,推动GLP-1的分泌,越来越多的实验证据为回肠转位术在推动2型糖尿病心肌胰岛素信号通路及葡萄糖转运改进方面提供可能。为探讨回肠转位术对心肌糖代谢功能、胰岛素信号通路及葡萄糖转运可能的意义及机制,本课题采取自发性非肥胖2型糖尿病Goto-Kakizaki (GK)大鼠为动物模型,首先确定GK大鼠在心肌糖代谢、胰岛素信号及葡萄糖转运方面的变化,行回肠转位术并监测术后体系性血糖内稳态、胰岛β细胞功能及胃肠道激素等变化,然后进一步探讨心肌葡萄糖摄取及胰岛素信号通路重要蛋白,并行体外心肌细胞培养,从期为手术治疗2型糖尿病改进心血管并发症提供论述支持及治疗依据。第一部分非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢及胰岛素信号变化非肥胖2型糖尿病GK大鼠作为自发性糖尿病大鼠模型,体现轻度血糖升高,葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能受损,显著的葡萄糖不耐受,外周胰岛素抵抗,这些都可能导致心肌受损。我们首先验证了GK大鼠心肌葡萄糖摄取功能,胰岛素信号及葡萄糖转运的变化。1. GK大鼠心肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取明显低于对照鼠为探讨心脏葡萄糖摄取的状况,我们收集各30只,8-10周龄GK大鼠极为对照大鼠Sprague-Dawley (SD)大鼠的新鲜心脏,首先进行心脏Langendorff灌注清洗残余血迹,然后在含有2D-3H-glucose的Krebs-Ringer's缓冲液中孵育一段时间后,加入胰岛素或者对照试剂刺激,最终检测心肌的葡萄糖摄取量。结果显示在没有胰岛素刺激(对照试剂)的状况下,GK大鼠心肌细胞的葡萄糖摄取与对照组无异；但是胰岛素刺激可从大大推动大鼠心肌的葡萄糖摄取,而GK大鼠心肌葡萄糖摄取量显著低于对照组。提示GK大鼠心肌葡萄糖摄取功能受损。2.GK大鼠心肌胰岛素信号通路变化胰岛素与胰岛素受体(Insupn Receptor, IR)的结合可从引起胰岛素信号通路几点列酪氨酸残基的自身磷酸化,这些磷酸化的酪氨酸残基可从被其衔接蛋白的Pr论文导读：蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低。胰岛素受体后水平的降低,提示心肌胰岛素受体酪氨酸激酶活化后的环节障碍。2.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K/Akt蛋白信号通路抑制IRS-1与PI3K蛋白的结合是胰岛素发生代谢意义的主要途径。而胰岛素受体/IRS/PI3K信号通路障碍,势必引起下游代谢受影响。本探讨通过新鲜心脏组织Co-IP实验证实GK大鼠心脏中
otein Tyrosine Binding domain (PTB)结构域识别,这其中从胰岛素受体底物(Insupn Receptor Substrate, IRS)蛋白为代表,这个历程引起了IRS蛋白重要酪氨酸残基的磷酸化,以而导致被Phosphoinositide3-kinases (PI3K)等脂质激酶激活而结合。本探讨着重于此信号通路的重要蛋白的mRNA及总蛋白表达,各自的磷酸化及IRS-1结合的PI3K。我们收集胰岛素或者葡萄糖刺激的GK大鼠及SD大鼠的新鲜心脏,提取总mRNA及蛋白质,使用RT-PCR、免疫印迹(Western blot)及免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)检测IR-β、IRS-1极为酪氨酸磷酸化、Akt (Protein Kinase B)总蛋白和磷酸化蛋白,从及胰岛素刺激的IRS-1结合的PI3K蛋白总量的表达。2.1胰岛素受体β (IR-β) mRNA、总蛋白极为磷酸化蛋白表达降低胰岛素受体作为跨膜的大分子蛋白,分为α、β两个亚基,胰岛素信号通路的激活,首先需要与α亚基结合而发生构型变化,导致跨膜的β亚基酪氨酸磷酸化,以而引起下游一系列信号的激活。故IR-β的总量与其磷酸化在胰岛素信号通路中起重要意义。本探讨通过RT-PCR、Western blot及免疫共沉淀等试验证实在GK大鼠心脏中IR-βmRNA、蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低,提示其心肌胰岛素受体水平的降低,以而预示心肌胰岛素信号可能有着受损状况。2.2胰岛素受体底物-1(IRS-1) mRNA、总蛋白极为磷酸化蛋白表达降低胰岛素受体底物也与胰岛素受体后水平的调节有关,其中IRS-1主要意义于横纹肌(骨骼肌、心肌),而IRS-2则广泛意义于肝脏、脂肪及骨骼肌等。有探讨证实在IRS-1-/-动物模型中,动物出现严重的胰岛素外周抵抗,证实IRS-1在胰岛素信号通路中的意义。本探讨通过RT-PCR、Western blot及Co-IP等试验证实在GK大鼠心脏中胰岛素受体底物rnRNA.蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低。胰岛素受体后水平的降低,提示心肌胰岛素受体酪氨酸激酶活化后的环节障碍。2.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K/Akt蛋白信号通路抑制IRS-1与PI3K蛋白的结合是胰岛素发生代谢意义的主要途径。而胰岛素受体/IRS/PI3K信号通路障碍,势必引起下游代谢受影响。本探讨通过新鲜心脏组织Co-IP实验证实GK大鼠心脏中IRS-1/PI3K结合显著降低,提示心肌胰岛素代谢意义受损。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,又被称蛋白激酶B (PKB)。作为IRS/PI3K信号通路F游的靶蛋白,其主要通过激活细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)来诱导细胞周期发展；对于细胞葡萄糖摄取方面,其通过增多葡萄糖转运因子4(GLUT4)的活性来实现,最终推动细胞生长；Akt活化后还可磷酸化糖原合成激酶3(GSK3)推动糖原合成,并可增多细胞无氧糖酵解水平。其对胰岛素葡萄糖代谢起着重要意义,其磷酸化水平与其活性密切相关。本探讨通过RT-PCR、Western blot及Co-IP等实验证实在GK大鼠心脏中Akt蛋白总量未变,而酪氨酸磷酸化降低,Akt活性的降低提示IRS/PI3K下游通路受损。3.GK大鼠葡萄糖转运蛋白表达变化葡萄糖转运蛋白是细胞转运葡萄糖的载体,其中葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)广泛的表达于各种组织,可从调节葡萄糖的摄取并且具有较强的亲和力；而GLUT4主要表达与脂肪组织和横纹肌中(主要有心肌和骨骼肌),在胰岛素刺激的状况下,能够有效的将葡萄糖及自身以细胞浆转运到细胞膜上,以而推动胰岛素刺激的葡萄糖转运。有探讨表明在Akt及PI3K都可从推动GLUT4的易位。为进一步探讨GK大鼠葡代谢通路的变化,本探讨收集大鼠的新鲜心肌,提取组织总mRNA、总蛋白及膜蛋白,采取RT-PCR、 Western blot办法,检测葡萄糖转运蛋白1及葡萄糖转运蛋白4的表达。结果证实葡萄糖转运蛋白1及葡萄糖转运蛋白4蛋白表达总量与对照鼠一致,而葡萄糖转运蛋白4膜蛋白表达量显著低于对照组SD大鼠,提示GK大鼠心肌葡萄糖转运能力下降。第二部分回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠血糖稳态及心肌葡萄摄取意义回肠转位术是将远端10cm回肠切除论文导读：后血糖稳定改进的因素之一。2.回肠转位术对动物心肌细胞葡萄糖摄取的影响葡萄糖摄取的作为血糖内稳态的重要指标。本探讨采取术后离体新鲜大鼠心脏,灌注后胰岛素刺激葡萄糖摄取,结果显示术后短期葡萄糖摄取没有显著改进,而术后6个月比较手术组与假手术组,心肌细胞葡萄糖摄取功能显著恢复。并且提示,回肠转位术可能推动心肌胰
并吻合到近端空肠,人为复制如Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)和胆胰转流术(Bipopancreatic diversion, BPD)手术后未消化的食糜提前到达接触远端回肠模型。此手术模型不会引起显著的营养不良或胃容量限制而引起探讨者的兴趣。有探讨显示,回肠转位术可从显著推动链脲佐菌素诱导SD糖尿病大鼠的胰岛素分泌,并且明显增多血清肠内分泌激素,如GLP-1、多肽YY激素(PYY)等浓度；也有试验显示回肠转位术后早期(10-45天)非肥胖型糖尿病大鼠胰岛素抵抗得到改进。为验证远端回肠在早期及长期葡萄糖耐受、血糖内稳态及胰岛β细胞功能改进方面是否起意义,并且与动物摄食及体重的转变的联系；同时,为探索回肠转位术在心肌葡萄糖摄取的意义,本探讨采取非肥胖2型糖尿病GK大鼠进行回肠转位术并进行一系列相关指标的探索。1.动物模型的评价雄性8-10周龄GK大鼠及相应同龄SD大鼠,术前常规检测进食量、体重、空腹血糖浓度,评估糖尿病模型及对照组的稳定性,其中空腹血糖≥7.0mmol／L,2h血糖≥11.1mmol/L的GK大鼠分为糖尿病手术组与糖尿病假手术组,SD大鼠皆为非糖尿病对照组。1.1术前手术组与假手术组评价常规术前检测糖尿病手术组与糖尿病假手术组食物摄取、体重、空腹血糖浓度、口服糖耐量实验(OGTT)、胰岛素抵抗(ITT),同时监测胰岛素β细胞功能(餐前后血清胰岛素、葡萄糖刺激的C肽)、胃肠内分泌激素(GLP-1、 GIP、PYY)分泌量,发现术前手术组与假手术组皆没有显著差别。1.2术后手术组与假手术组评价1.2.1各组动物手术评价常规记录手术时间及成功率,观察并严格记录术后并发症及恢复状况。两组动物平均手术时间及术后恢复时间无显著差别,手术成功率100%,其中手术组及假手术组各死亡2只,死亡率6.7%,死亡理由分别为术后肠梗阻及吻合口漏。该探讨证明回肠转位术与假手术相比,术式安全可靠。1.2.2回肠转位术对动物进食、体重、空腹血糖、口服糖耐量及胰岛素抵抗的影响术后常规多个时间点记录动物食物摄取量,体重及空腹血糖浓度并行口服糖耐最实验和胰岛索抵抗实验。结果显示,术后动物摄食量第4周与假手术组出现显著差别,体重在第8周出现差别。而血糖及糖耐量、胰岛素抵抗改进都早于摄食和体重的转变,提示手术对于葡萄糖内稳态的改进意义可能不依赖于体重和摄食量的变化。同时,通过6个月的检测,手术组血糖维持稳定,有明显改进,故回肠转位术对血糖的改进是长期(6个月)而稳定的。1.2.3回肠转位术对胰岛p细胞功能影响胰岛p细胞功能是指胰岛β细胞在葡萄糖的刺激下,分泌胰岛素从保持稳定的机体血糖水平的功能。测定胰岛p细胞功能手段之一是测量血清胰岛素含量和C肽水平。为了证实回肠转位术在胰岛素p细胞功能改进的意义,收集大鼠空腹或者胃灌注葡萄糖后血清,采取酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中胰岛素及C肽水平。结果证实,回肠转位术能够推动血清胰岛素及C肽分泌,改进胰岛β细胞功能。1.2.4回肠转位术对胃肠激素分泌影响为了探讨回肠转位术对胃肠激素分泌的影响,本探讨测定大鼠血清样本中GLP-1、PYY及GIP的含量。有探讨证实,胃旁路手术后血清GLP-1、PYY持续性显著增多,而在动物实验中,GLP-1已经被证实能推动胰岛素分泌,增多胰岛β细胞的增殖和抑制其凋亡。GLP-1通过直接与胰岛p细胞的受体直接结合而起意义；另有人体实验证据表明,减肥手术后GLP-1的升高能引起较长期的高胰岛素低血糖状态；而关于PYY的动物减肥手术探讨也证实其可从推动胰岛β细胞功能的增强。GIP又称为葡萄糖依赖性胰岛素释放肽,是一个42个氨基酸的多肽,主要由十二指肠和空肠黏膜细胞分泌。在高血糖情况下其可从推动胰岛β细胞分泌胰岛素,目前关于其在肥胖和2型糖尿病减肥手术的生理功能探讨问题。通过对照探讨,发现术后血清GLP-1,PYY显著较假手术组升高,但是GIP的分泌区别不大,预示GIP可能不是减肥手术后血糖稳定改进的因素之一。2.回肠转位术对动物心肌细胞葡萄糖摄取的影响葡萄糖摄取的作为血糖内稳态的重要指标。本探讨采取术后离体新鲜大鼠心脏,灌注后胰岛素刺激葡萄糖摄取,结果显示术后短期葡萄糖摄取没有显著改进,而术后6个月比较手术组与假手术组,心肌细胞葡萄糖摄取功能显著恢复。并且提示,回肠转位术可能推动心肌胰论文导读：
岛素信号及葡萄糖转运功能。第三部分回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改进机制探讨前期探讨证明非肥胖2型糖尿病大鼠心肌胰岛素信号机葡萄糖转运受损,而多篇文献报道回肠转位术在改进血糖内稳态的意义,然而机制并未阐明。本探讨第二部分探讨发现回肠转位术改进动物整体及心肌细胞的糖代谢,推动胰岛p细胞功能改进及胃肠激素分泌,为了进一步阐明该手术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改进的机制,本部分首先使用大鼠新鲜心脏及骨骼肌,采取Western blot及免疫沉淀等分子生物学技术,对胰岛素信号通路及葡萄糖转运蛋白进行探讨。同时,本部分分离非肥胖2型糖尿病GK大鼠心肌细胞进行培养,行体外实验,并利用GLP-1极为受体激动剂Ex-4刺激培养细胞,探索GLP-1在心肌胰岛素信号及葡萄糖转运代谢中可能有着的意义机制,为药物及手术治疗糖尿病提供可能的思路及论述支持。1.回肠转位术对心肌胰岛素信号的影响1.1胰岛素受体-p(IR-β)极为磷酸化蛋白表达增多术后6个月回肠转位术组大鼠心脏IR-β显著增多,并且磷酸化IR-β蛋白表达量与IR-β蛋白总量变化走势相同,表明磷酸化蛋白增多可能与IR-β蛋白总量增多呈正相关,提示术后大鼠心肌胰岛素信号有着改进1.2胰岛素受体底物-1(IRS-1)极为磷酸化蛋白表达增多IRS-1极为磷酸化早在术后1个月即发生显著变化,而术后6个月回肠转位术手术组与假手术组中蛋白表达总量区别更显著。1.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K蛋白信号通路改进IRS-1结合的P13K活性增多被认为是胰岛素抵抗改进的重要指标之一。我们采取免疫共沉淀法检测IRS-1结合的PI3K活性表达,通过比较术后1个月及6个月IRS一1结合的PI3K蛋白表达量,发现术后1个月其表达量就有增多,而术后6个月IRS-1结合的PI3K增多更显著,而术后1个月与6个月相比差异有统计学作用(p0.05)。2.回肠转位术对心肌及骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白的影响本课题测定骨骼肌及心肌组织中GLUT4,总蛋白及细胞膜含量的表达。所有分组总GLUT4表达量未见显著区别。术后1个月细胞膜蛋白GLUT4表达量增多,而6个月后增多量更加显著。3.GLP-1极为受体激动剂在GK大鼠体外心肌细胞培养中胰岛素样意义通过离体心肌细胞培养从及对照探讨实验,我们发现GLP-1极为受体激动剂Ex-4都有着拟胰岛素样意义,其可从推动葡萄糖摄取及IRS-1结合的PI3K活性增多。本探讨以而通过体外实验,证明第二部分中回肠转位术增多的血清GLP-1的分泌,而血清GLP-1增多又能推动心肌细胞的胰岛素信号通路改进和葡萄糖代谢摄取增多,以而正向推动GK大鼠整体及心肌胰岛素信号及葡萄糖转运的改进。关键词：回肠转位术论文2型糖尿病论文心肌胰岛素信号论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要8-17
ABSTRACT17-26
符号说明26-30
前言30-33
第一部分 非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢及胰岛素信号变化33-69
技术路线33-34
材料与办法34-50
结果50-59
讨论59-62
结论62-63
参考文献63-69
第二部分 回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠血糖稳态及心肌葡萄摄取意义69-100
技术路线69-70
材料与办法70-77
结果77-79
讨论79-83
结论83-84
附图表84-96
参考文献96-100
第三部分 回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改进机制探讨100-120
技术路线100-101
材料与办法101-107
结果107-113
讨论113-117
结论117
参考文献117-120
致谢120-121
攻读学位期间发表的学术论文及获奖状况121-122
学位论文评阅及答辩状况表122-123
英文文章 1123-150
英文文章 2150-170
摘要：目前全球有2.8亿糖尿病患者,发病率逐年升高,并且体现出年轻化走势,其中90%是2型糖尿病(Type2diabetes melptus, T2DM),仅美国就有2800万2型糖尿病患者,占到总人口7%。在2007年糖尿病死亡率位列第七位。目前探讨认为2型糖尿病的发病是多因素的结果,尤其是从遗传及不良生活习惯为主,而内科相关治疗手段,如增多运动量、限制食物摄取、利用降糖药物及胰岛素等,均不能使其根除。由于需要长期坚持治疗甚至维持终生,患者依以性差,使血糖水平不能维持在正常水平范围之内,导致各种并发症的发生。2型糖尿病长期血糖制约不佳除了引起失明、肾病、神经体系疾病及孕期并发症外,还要面临持续高发的由于心肌梗死导致的充血性心力衰竭和死亡,而扩张性心肌病的发病率越来越高,有探讨表明大约有60%的2型糖尿病患者体现心肌收缩功能的失调。糖尿病患者消耗大量公共医疗资源,医疗费用是正常非糖尿病患者的两到三倍。美国每年为糖尿病患者投入1740亿美元,预计到2020年要增多到1920亿美元,其中67%直接与糖尿病相关。由此,寻找安全、长效、依以性高的治疗办法成为全球关注的热点,而关于2型糖尿病相关治疗机制值得深入研究。减肥手术(Bariatric surgery)作为探讨热点,有越来越多的探讨针对各种手术模式、短期或长期的葡萄糖稳态的改进而进行。目前探讨认为,减肥手术后患者通过能量摄入减少及胰岛素相关胃肠道激素的分泌变化而改进血糖内稳态,最终起到血糖制约的意义。回肠转位术(Ileal transposition, IT)的理念首次在1982年被Koopmans HS等人在肥胖动物实验模型中提出。而此术式首先在非肥胖型2型糖尿病大鼠中与其他术式(如胃旁路术,胆胰转流术等)相比有效的缩短了手术操作从及术后恢复时间。另外,血糖制约改进常常发生于体重显著减轻之前,预示手术在2型糖尿病改进中的直接意义,而不是继发于体重减轻和肥胖消除。这些发现揭示了远端回肠内分泌激素机制可能参与了术后非肥胖2型糖尿病的恢复。同时,胰高血糖素样肽(Glucagon-pke peptide-1, GLP-1)作为有效的胰岛素释放推动剂,已经被实验证实可从推动正常和缺血再灌注后心脏的葡萄糖摄取。回肠转位术延迟了近端肠管与摄入食物的接触而推动回肠与食物接触,保持了肠管的完整性,推动GLP-1的分泌,越来越多的实验证据为回肠转位术在推动2型糖尿病心肌胰岛素信号通路及葡萄糖转运改进方面提供可能。为探讨回肠转位术对心肌糖代谢功能、胰岛素信号通路及葡萄糖转运可能的意义及机制,本课题采取自发性非肥胖2型糖尿病Goto-Kakizaki (GK)大鼠为动物模型,首先确定GK大鼠在心肌糖代谢、胰岛素信号及葡萄糖转运方面的变化,行回肠转位术并监测术后体系性血糖内稳态、胰岛β细胞功能及胃肠道激素等变化,然后进一步探讨心肌葡萄糖摄取及胰岛素信号通路重要蛋白,并行体外心肌细胞培养,从期为手术治疗2型糖尿病改进心血管并发症提供论述支持及治疗依据。第一部分非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢及胰岛素信号变化非肥胖2型糖尿病GK大鼠作为自发性糖尿病大鼠模型,体现轻度血糖升高,葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能受损,显著的葡萄糖不耐受,外周胰岛素抵抗,这些都可能导致心肌受损。我们首先验证了GK大鼠心肌葡萄糖摄取功能,胰岛素信号及葡萄糖转运的变化。1. GK大鼠心肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取明显低于对照鼠为探讨心脏葡萄糖摄取的状况,我们收集各30只,8-10周龄GK大鼠极为对照大鼠Sprague-Dawley (SD)大鼠的新鲜心脏,首先进行心脏Langendorff灌注清洗残余血迹,然后在含有2D-3H-glucose的Krebs-Ringer's缓冲液中孵育一段时间后,加入胰岛素或者对照试剂刺激,最终检测心肌的葡萄糖摄取量。结果显示在没有胰岛素刺激(对照试剂)的状况下,GK大鼠心肌细胞的葡萄糖摄取与对照组无异；但是胰岛素刺激可从大大推动大鼠心肌的葡萄糖摄取,而GK大鼠心肌葡萄糖摄取量显著低于对照组。提示GK大鼠心肌葡萄糖摄取功能受损。2.GK大鼠心肌胰岛素信号通路变化胰岛素与胰岛素受体(Insupn Receptor, IR)的结合可从引起胰岛素信号通路几点列酪氨酸残基的自身磷酸化,这些磷酸化的酪氨酸残基可从被其衔接蛋白的Pr论文导读：蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低。胰岛素受体后水平的降低,提示心肌胰岛素受体酪氨酸激酶活化后的环节障碍。2.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K/Akt蛋白信号通路抑制IRS-1与PI3K蛋白的结合是胰岛素发生代谢意义的主要途径。而胰岛素受体/IRS/PI3K信号通路障碍,势必引起下游代谢受影响。本探讨通过新鲜心脏组织Co-IP实验证实GK大鼠心脏中
otein Tyrosine Binding domain (PTB)结构域识别,这其中从胰岛素受体底物(Insupn Receptor Substrate, IRS)蛋白为代表,这个历程引起了IRS蛋白重要酪氨酸残基的磷酸化,以而导致被Phosphoinositide3-kinases (PI3K)等脂质激酶激活而结合。本探讨着重于此信号通路的重要蛋白的mRNA及总蛋白表达,各自的磷酸化及IRS-1结合的PI3K。我们收集胰岛素或者葡萄糖刺激的GK大鼠及SD大鼠的新鲜心脏,提取总mRNA及蛋白质,使用RT-PCR、免疫印迹(Western blot)及免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)检测IR-β、IRS-1极为酪氨酸磷酸化、Akt (Protein Kinase B)总蛋白和磷酸化蛋白,从及胰岛素刺激的IRS-1结合的PI3K蛋白总量的表达。2.1胰岛素受体β (IR-β) mRNA、总蛋白极为磷酸化蛋白表达降低胰岛素受体作为跨膜的大分子蛋白,分为α、β两个亚基,胰岛素信号通路的激活,首先需要与α亚基结合而发生构型变化,导致跨膜的β亚基酪氨酸磷酸化,以而引起下游一系列信号的激活。故IR-β的总量与其磷酸化在胰岛素信号通路中起重要意义。本探讨通过RT-PCR、Western blot及免疫共沉淀等试验证实在GK大鼠心脏中IR-βmRNA、蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低,提示其心肌胰岛素受体水平的降低,以而预示心肌胰岛素信号可能有着受损状况。2.2胰岛素受体底物-1(IRS-1) mRNA、总蛋白极为磷酸化蛋白表达降低胰岛素受体底物也与胰岛素受体后水平的调节有关,其中IRS-1主要意义于横纹肌(骨骼肌、心肌),而IRS-2则广泛意义于肝脏、脂肪及骨骼肌等。有探讨证实在IRS-1-/-动物模型中,动物出现严重的胰岛素外周抵抗,证实IRS-1在胰岛素信号通路中的意义。本探讨通过RT-PCR、Western blot及Co-IP等试验证实在GK大鼠心脏中胰岛素受体底物rnRNA.蛋白总量及酪氨酸磷酸化降低。胰岛素受体后水平的降低,提示心肌胰岛素受体酪氨酸激酶活化后的环节障碍。2.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K/Akt蛋白信号通路抑制IRS-1与PI3K蛋白的结合是胰岛素发生代谢意义的主要途径。而胰岛素受体/IRS/PI3K信号通路障碍,势必引起下游代谢受影响。本探讨通过新鲜心脏组织Co-IP实验证实GK大鼠心脏中IRS-1/PI3K结合显著降低,提示心肌胰岛素代谢意义受损。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,又被称蛋白激酶B (PKB)。作为IRS/PI3K信号通路F游的靶蛋白,其主要通过激活细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)来诱导细胞周期发展；对于细胞葡萄糖摄取方面,其通过增多葡萄糖转运因子4(GLUT4)的活性来实现,最终推动细胞生长；Akt活化后还可磷酸化糖原合成激酶3(GSK3)推动糖原合成,并可增多细胞无氧糖酵解水平。其对胰岛素葡萄糖代谢起着重要意义,其磷酸化水平与其活性密切相关。本探讨通过RT-PCR、Western blot及Co-IP等实验证实在GK大鼠心脏中Akt蛋白总量未变,而酪氨酸磷酸化降低,Akt活性的降低提示IRS/PI3K下游通路受损。3.GK大鼠葡萄糖转运蛋白表达变化葡萄糖转运蛋白是细胞转运葡萄糖的载体,其中葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)广泛的表达于各种组织,可从调节葡萄糖的摄取并且具有较强的亲和力；而GLUT4主要表达与脂肪组织和横纹肌中(主要有心肌和骨骼肌),在胰岛素刺激的状况下,能够有效的将葡萄糖及自身以细胞浆转运到细胞膜上,以而推动胰岛素刺激的葡萄糖转运。有探讨表明在Akt及PI3K都可从推动GLUT4的易位。为进一步探讨GK大鼠葡代谢通路的变化,本探讨收集大鼠的新鲜心肌,提取组织总mRNA、总蛋白及膜蛋白,采取RT-PCR、 Western blot办法,检测葡萄糖转运蛋白1及葡萄糖转运蛋白4的表达。结果证实葡萄糖转运蛋白1及葡萄糖转运蛋白4蛋白表达总量与对照鼠一致,而葡萄糖转运蛋白4膜蛋白表达量显著低于对照组SD大鼠,提示GK大鼠心肌葡萄糖转运能力下降。第二部分回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠血糖稳态及心肌葡萄摄取意义回肠转位术是将远端10cm回肠切除论文导读：后血糖稳定改进的因素之一。2.回肠转位术对动物心肌细胞葡萄糖摄取的影响葡萄糖摄取的作为血糖内稳态的重要指标。本探讨采取术后离体新鲜大鼠心脏,灌注后胰岛素刺激葡萄糖摄取,结果显示术后短期葡萄糖摄取没有显著改进,而术后6个月比较手术组与假手术组,心肌细胞葡萄糖摄取功能显著恢复。并且提示,回肠转位术可能推动心肌胰
并吻合到近端空肠,人为复制如Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)和胆胰转流术(Bipopancreatic diversion, BPD)手术后未消化的食糜提前到达接触远端回肠模型。此手术模型不会引起显著的营养不良或胃容量限制而引起探讨者的兴趣。有探讨显示,回肠转位术可从显著推动链脲佐菌素诱导SD糖尿病大鼠的胰岛素分泌,并且明显增多血清肠内分泌激素,如GLP-1、多肽YY激素(PYY)等浓度；也有试验显示回肠转位术后早期(10-45天)非肥胖型糖尿病大鼠胰岛素抵抗得到改进。为验证远端回肠在早期及长期葡萄糖耐受、血糖内稳态及胰岛β细胞功能改进方面是否起意义,并且与动物摄食及体重的转变的联系；同时,为探索回肠转位术在心肌葡萄糖摄取的意义,本探讨采取非肥胖2型糖尿病GK大鼠进行回肠转位术并进行一系列相关指标的探索。1.动物模型的评价雄性8-10周龄GK大鼠及相应同龄SD大鼠,术前常规检测进食量、体重、空腹血糖浓度,评估糖尿病模型及对照组的稳定性,其中空腹血糖≥7.0mmol／L,2h血糖≥11.1mmol/L的GK大鼠分为糖尿病手术组与糖尿病假手术组,SD大鼠皆为非糖尿病对照组。1.1术前手术组与假手术组评价常规术前检测糖尿病手术组与糖尿病假手术组食物摄取、体重、空腹血糖浓度、口服糖耐量实验(OGTT)、胰岛素抵抗(ITT),同时监测胰岛素β细胞功能(餐前后血清胰岛素、葡萄糖刺激的C肽)、胃肠内分泌激素(GLP-1、 GIP、PYY)分泌量,发现术前手术组与假手术组皆没有显著差别。1.2术后手术组与假手术组评价1.2.1各组动物手术评价常规记录手术时间及成功率,观察并严格记录术后并发症及恢复状况。两组动物平均手术时间及术后恢复时间无显著差别,手术成功率100%,其中手术组及假手术组各死亡2只,死亡率6.7%,死亡理由分别为术后肠梗阻及吻合口漏。该探讨证明回肠转位术与假手术相比,术式安全可靠。1.2.2回肠转位术对动物进食、体重、空腹血糖、口服糖耐量及胰岛素抵抗的影响术后常规多个时间点记录动物食物摄取量,体重及空腹血糖浓度并行口服糖耐最实验和胰岛索抵抗实验。结果显示,术后动物摄食量第4周与假手术组出现显著差别,体重在第8周出现差别。而血糖及糖耐量、胰岛素抵抗改进都早于摄食和体重的转变,提示手术对于葡萄糖内稳态的改进意义可能不依赖于体重和摄食量的变化。同时,通过6个月的检测,手术组血糖维持稳定,有明显改进,故回肠转位术对血糖的改进是长期(6个月)而稳定的。1.2.3回肠转位术对胰岛p细胞功能影响胰岛p细胞功能是指胰岛β细胞在葡萄糖的刺激下,分泌胰岛素从保持稳定的机体血糖水平的功能。测定胰岛p细胞功能手段之一是测量血清胰岛素含量和C肽水平。为了证实回肠转位术在胰岛素p细胞功能改进的意义,收集大鼠空腹或者胃灌注葡萄糖后血清,采取酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中胰岛素及C肽水平。结果证实,回肠转位术能够推动血清胰岛素及C肽分泌,改进胰岛β细胞功能。1.2.4回肠转位术对胃肠激素分泌影响为了探讨回肠转位术对胃肠激素分泌的影响,本探讨测定大鼠血清样本中GLP-1、PYY及GIP的含量。有探讨证实,胃旁路手术后血清GLP-1、PYY持续性显著增多,而在动物实验中,GLP-1已经被证实能推动胰岛素分泌,增多胰岛β细胞的增殖和抑制其凋亡。GLP-1通过直接与胰岛p细胞的受体直接结合而起意义；另有人体实验证据表明,减肥手术后GLP-1的升高能引起较长期的高胰岛素低血糖状态；而关于PYY的动物减肥手术探讨也证实其可从推动胰岛β细胞功能的增强。GIP又称为葡萄糖依赖性胰岛素释放肽,是一个42个氨基酸的多肽,主要由十二指肠和空肠黏膜细胞分泌。在高血糖情况下其可从推动胰岛β细胞分泌胰岛素,目前关于其在肥胖和2型糖尿病减肥手术的生理功能探讨问题。通过对照探讨,发现术后血清GLP-1,PYY显著较假手术组升高,但是GIP的分泌区别不大,预示GIP可能不是减肥手术后血糖稳定改进的因素之一。2.回肠转位术对动物心肌细胞葡萄糖摄取的影响葡萄糖摄取的作为血糖内稳态的重要指标。本探讨采取术后离体新鲜大鼠心脏,灌注后胰岛素刺激葡萄糖摄取,结果显示术后短期葡萄糖摄取没有显著改进,而术后6个月比较手术组与假手术组,心肌细胞葡萄糖摄取功能显著恢复。并且提示,回肠转位术可能推动心肌胰论文导读：
岛素信号及葡萄糖转运功能。第三部分回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改进机制探讨前期探讨证明非肥胖2型糖尿病大鼠心肌胰岛素信号机葡萄糖转运受损,而多篇文献报道回肠转位术在改进血糖内稳态的意义,然而机制并未阐明。本探讨第二部分探讨发现回肠转位术改进动物整体及心肌细胞的糖代谢,推动胰岛p细胞功能改进及胃肠激素分泌,为了进一步阐明该手术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改进的机制,本部分首先使用大鼠新鲜心脏及骨骼肌,采取Western blot及免疫沉淀等分子生物学技术,对胰岛素信号通路及葡萄糖转运蛋白进行探讨。同时,本部分分离非肥胖2型糖尿病GK大鼠心肌细胞进行培养,行体外实验,并利用GLP-1极为受体激动剂Ex-4刺激培养细胞,探索GLP-1在心肌胰岛素信号及葡萄糖转运代谢中可能有着的意义机制,为药物及手术治疗糖尿病提供可能的思路及论述支持。1.回肠转位术对心肌胰岛素信号的影响1.1胰岛素受体-p(IR-β)极为磷酸化蛋白表达增多术后6个月回肠转位术组大鼠心脏IR-β显著增多,并且磷酸化IR-β蛋白表达量与IR-β蛋白总量变化走势相同,表明磷酸化蛋白增多可能与IR-β蛋白总量增多呈正相关,提示术后大鼠心肌胰岛素信号有着改进1.2胰岛素受体底物-1(IRS-1)极为磷酸化蛋白表达增多IRS-1极为磷酸化早在术后1个月即发生显著变化,而术后6个月回肠转位术手术组与假手术组中蛋白表达总量区别更显著。1.3胰岛素刺激的IRS-1/PI3K蛋白信号通路改进IRS-1结合的P13K活性增多被认为是胰岛素抵抗改进的重要指标之一。我们采取免疫共沉淀法检测IRS-1结合的PI3K活性表达,通过比较术后1个月及6个月IRS一1结合的PI3K蛋白表达量,发现术后1个月其表达量就有增多,而术后6个月IRS-1结合的PI3K增多更显著,而术后1个月与6个月相比差异有统计学作用(p0.05)。2.回肠转位术对心肌及骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白的影响本课题测定骨骼肌及心肌组织中GLUT4,总蛋白及细胞膜含量的表达。所有分组总GLUT4表达量未见显著区别。术后1个月细胞膜蛋白GLUT4表达量增多,而6个月后增多量更加显著。3.GLP-1极为受体激动剂在GK大鼠体外心肌细胞培养中胰岛素样意义通过离体心肌细胞培养从及对照探讨实验,我们发现GLP-1极为受体激动剂Ex-4都有着拟胰岛素样意义,其可从推动葡萄糖摄取及IRS-1结合的PI3K活性增多。本探讨以而通过体外实验,证明第二部分中回肠转位术增多的血清GLP-1的分泌,而血清GLP-1增多又能推动心肌细胞的胰岛素信号通路改进和葡萄糖代谢摄取增多,以而正向推动GK大鼠整体及心肌胰岛素信号及葡萄糖转运的改进。关键词：回肠转位术论文2型糖尿病论文心肌胰岛素信号论文
本论文由www.7ctime.com,需要可从关系人员哦。中文摘要8-17
ABSTRACT17-26
符号说明26-30
前言30-33
第一部分 非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢及胰岛素信号变化33-69
技术路线33-34
材料与办法34-50
结果50-59
讨论59-62
结论62-63
参考文献63-69
第二部分 回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠血糖稳态及心肌葡萄摄取意义69-100
技术路线69-70
材料与办法70-77
结果77-79
讨论79-83
结论83-84
附图表84-96
参考文献96-100
第三部分 回肠转位术对非肥胖2型糖尿病大鼠心肌糖代谢改进机制探讨100-120
技术路线100-101
材料与办法101-107
结果107-113
讨论113-117
结论117
参考文献117-120
致谢120-121
攻读学位期间发表的学术论文及获奖状况121-122
学位论文评阅及答辩状况表122-123
英文文章 1123-150
英文文章 2150-170